Mechanismen der Entamoeba histolytica-Chemotherapie

Der einzellige Parasit Entamoeba histolytica ist weltweit Verursacher von signifikanter Morbidität und Mortalität und ist für mindestens 40 000 Todesfälle pro Jahr verantwortlich. Die Nitroimidazole mit dem Hauptvertreter Metronidazol sind derzeit die einzige Klasse von Chemotherapeutika, die für die Behandlung der invasiven Amöbiasis verwendet wird. Alkylphosphocholine (Alkyl-PCs) wurden ursprünglich als Antitumormittel entwickelt, aber sie sind auch gegen einige humanpathogene Einzeller aktiv. Erst vor kurzem wurden sie erfolgreich für die Behandlung der viszeralen Leishmaniose, der gefürchteten Kala Azar Krankheit, eingesetzt. In unserem Labor konnten wir zeigen, daß Alkyl-PCs auch zytotoxisch für E. histolytica sind. Im beantragten Projekt planen wir, die Wirkung der neuen Alkyl-PCs und der etablierten Substanz Metronidazol auf die Amöben zu untersuchen. Das Ziel der Studie ist es, einen Beitrag zum besseren Verständnis der zytotoxischen Aktivität von Alkyl-PCs und Metronidazol zu leisten, um Wege zur weiteren Verbesserung der gegen Amöben gerichteten Chemotherapie zu eröffnen. Wir wollen dieses Ziel verfolgen, indem wir die Reaktion des Parasiten auf die beiden Stoffgruppen auf molekularer Ebene untersuchen. Dabei wollen wir den Parasiten einerseits für kurze Zeit zytotoxischen Konzentrationen der Substanzen aussetzen, andererseits über einige Monate versuchen, den Parasiten an steigende sublethale Dosen zu gewöhnen, bis sich zumindest eine Teilresistenz entwickelt. Die Reaktion des Parasiten soll untersucht werden (1), indem Änderungen auf der Proteinebene mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese durch das Auftauchen oder Verschwinden von Signalen erkennbar gemacht werden, (2) indem RNA aus den Parasiten extrahiert wird, und die Veränderungen auf der mRNA-Ebene mit molekularbiologischen Methoden wie der Kombination aus subtraktiver Hybridisierung und Amplifikation oder der Hybridisierung von fluoreszenzmarkierter cDNA an Oligonukleotid-Arrays gemessen werden. Das Ziel ist die Identifizierung von Proteinen, die bei der Einwirkung der Substanzen auf den Parasiten ein- oder ausgeschaltet werden. Im weiteren Verlauf wollen wir mit biochemischen und molekularbiologischen Methoden untersuchen, was diese Veränderungen auf funktioneller Ebene bedeuten, und welche Reaktionsmuster sich in E. histolytica manifestieren. Wir erwarten, daß die differenzierte Übersicht über die molekularen Reaktionsmuster der Amöben zu neuen Ideen für die Verbesserung der Chemotherapie der Amoebiasis führen könnten.

Jedes Jahr fordern Infektionen mit dem Einzeller Entamoeba histolytica bis zu 100.000 Opfer durch Erkrankungen wie die Amöbendysenterie und den Amöbenleberabszeß. Die Amöbiasis wird praktisch ausschließlich mit Metronidazol behandelt, einem Antibiotikum, das für verschiedene anaerobe und mikroaerophile Mikroorganismen verwendet wird. Es ist gut etabliert, dass Metronidazol chemisch reduziert werden muss, um aktiv zu werden, aber man weiß sehr wenig darüber, wie die toxischen Produkte genau die Amöben schädigen und ob sie in der Lage sind, auf die Vergiftung sinnvoll zu reagieren. Erstaunlicherweise zeigten die Amöben keine signifikante Antwort auf den Stress der Metronidazolbehandlung, weder beobachteten wir Proteinneusynthese noch die Synthese von neuen mRNAs. Wenn die Gesamtheit aller löslichen Proteine von behandelten und unbehandelten Amöben mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese aufgetrennt wurde, dann zeigte die genaue Analyse, dass 5 von mehr als 1000 Proteinen chemisch modifiziert worden waren, und dass sich das aktivierte Metronidazol chemisch an sie gebunden hatte. Diese Proteine konnten als Thioredoxinreduktase, Thioredoxin, Superoxiddismutase, Purinnukleosidphosphorylase und ein weiteres Protein unbekannter Funktion identifiziert werden. Wir entdeckten, dass eines dieser Enzyme, Thioredoxinreduktase, selbst das Metronidazol aktiviert und dadurch als erstes modifiziert wird. Neben seiner Wirkung auf Proteine verminderte das aktivierte Metronidazol auch die Menge von freiem Zystein in den Amöben. Die gefundenen Vorgänge stellen einen massiven Angriff auf das System dar, das Amöben vor oxidativem Schaden bewahrt, und sie definieren einen neuen Wirkmechanismus für dieses wichtige Antibiotikum. Dieser Wirkmechanismus könnte auch bei anderen Mikroorganismen eine Rolle spielen, in diesem Sinne fanden wir auch bei Trichomonas vaginalis eine Modifikation der Thioredoxinreduktase. Insgesamt hat das Projekt zum ersten Mal die Proteinstrukturen identifiziert, die getroffen werden, wenn die Amöben mit Metronidazol behandelt werden. Daraus resultiert nicht nur eine neue Hypothese über den Wirkmechanismus, sondern die Kenntnis der Zielstrukturen eröffnet auch neue Möglichkeiten für die Suche nach neuen Mitteln gegen Amöben, die natürlich auch wieder gegen andere pathogene Mikroorganismen wirksam sein könnten. Die Teilnahme am E. histolytica Genomprojekt und die Suche nach Enzymgenen und Etablierung von Stoffwechselwegen war eine weitere wichtige Erfahrung. Unsere Arbeit hat ganz als Grundlagenforschung begonnen, aber ein besseres Verständnis der Vorgänge kann auch einmal zu besseren Ideen für die Behandlung der Amöbiasis führen. Schließlich sind unsere Ergebnisse nicht nur für den einen Parasiten interessant, und eröffnen auch viele neue Fragen nicht nur auf unserem Gebiet.