Stabilität von RNA Tertiärstrukturelementen

RNA Moleküle sind nicht nur Träger genetischer Information, sondern oft funktionelle Moleküle und somit terminale Genprodukte. Um ihre Wirkung entfalten zu können, müssem sich diese RNA Moleküle in definierte dreidimensionale Strukturen falten. Während die Faltung von zweidimensionalen Strukturen gut bekannt ist und deren Voraussage oft richtig ist, ist die Voraussage von dreidimensionalen Strukturen unmöglich, weil deren thermodynamischen Parameter unbekannt sind. In diesem Projektantrag schlagen wir vor, die Stabilität von tertiären Strukturelementen sowohl in inter- als auch in intramolekularen Wechselwirkungen zu messen. Die intermolekularen Interaktionen werden wir an Hand der Dimerisierungsstelle (DIS) des humanen HI Virus untersuchen. Das HIV Genom wird als Dimer in sein Kapsid verpackt, wobei diese durch Basenpaarung über eine kurze komplementäre Sequenz erfolgt. Die Dimerisierung wird über eine Haarnadelschleife der Initiationstelle induziert, welche sich basenpaart mit der selben Sequenz eines identischen zweiten Moleküls, einer Struktur die "kissing Komplex" genannt wird. Wir werden systematisch die thermodynamischen Parameter für kissing Komplexe messen und kinetisch die Umwandlung dieser kurzen Komplexe in die erweiterten Paarungskomplexe verfolgen. Um dies tun zu können, haben wir ein Ribozym gekoppeltes System entwickelt, bei dem sich der erweiterte Komplex in ein Ribozym faltet und zur Spaltung eines der RNA Stränge führt. Wir wollen antisense Ribozyme entwickeln, die Basenpaarung über kissing Komplexe initiieren. Die intramolekularen Interaktionen werden wir an Hand des autokatalytischen td Gruppe I Introns untersuchen. Der Faltungsprozess dieser RNA wird sowohl in vitro als auch in vivo verfolgt, wobei wir den Beitrag einzelner Interaktionen für den Faltungsweg als auch für die Stabilität der Struktur erfassen werden. Wir werden Mutationen in die Tertiärstrukturelemente einführen und deren Impakt auf Faltung und Stabilität messen. Das Verständnis des Mechanismus der RNA-RNA Wechselwirkung (auch "RNA annealing" genannt) sollte das Entwerfen von therapeutischen RNAs, die gegen krankheitserregende Moleküle gerichtet sind, ermöglichen. Die Neuheit unseres Ansatzes ist die Strategie, kissing Komplexe zu verwenden um die Wechselwirkung zwischen RNA Molekülen zu erleichtern. Wir hoffen, daß diese Strategie die Effizienz von Antisense Ribozymen erhöhen wird.

Die meisten Lebewesen speichern ihre genetische Information in Form von DNA (Desoxyribonukleinsäure) und nur wenige Viren speichern dies in Form von RNA (Ribonukleinsäure), wie zum Beispiel das Retrovirus HIV. Diese RNA Genome enthalten komplexe Informationen, nicht nur um die essentiellen Proteine herzustellen, sondern die Primär-, Sekundär- und Tertiärstrukturen der RNA enthalten viele Signale, die notwendig sind damit das Virus sich vermehrt. Das Verständnis dieser Signale und Strukturen könnte eventuel Angriffspunkte für eine mögliche Therapie zu Tage bringen. Wir wollen die dreidimensional Struktur von RNA Molekülen verstehen und haben das Dimerisierungssignal von HIV (HIV-1 DIS) als Modellsystem verwendet. Diese DIS Domäne ist essentiel für die Replikation von HIV als auch für die Verpackung des "diploiden" Genoms im viralen Partikel. Wir haben die thermodynamischen Parameter von HIV-1 DIS-ähnlichen "loop-loop" Interaktionen sowohl in vitro als auch innerhalb lebender Zellen bestimmt. Diese Parameter sollen helfen grundsätzliche Prinzipien zu verstehen, welche die RNA Faltung und die Stabilität der Tertiärstruktur der RNA beherrschen.