Analyse des EWS-FLI1 onkogenen Pathways mittels RNAi

Das chimäre EWS-FLI1 Genprodukt in Ewing Sarkomen repräsentiert den Prototyp einer Gruppe DNA-bindender, tumorspezifischer Fusionsproteine, welche TET Proteinfamilienmitglieder involvieren und als Folge chromosomaler Translokationen in humanen Sarkomen und akuten Leukämien entstehen. Experimentelle Daten legen eine Funktion dieser Proteine als transkriptionelle Regulatoren nahe. Ausserdem weisen Proteininteraktionsstudien auf eine Verbindung mit der RNA Prozessierung und mit der DNA Reparatur hin. Inwieweit diese Aktivitäten zu den onkogenen Eigenschaften der Translokationsprodukte beitragen, bleibt jedoch ungeklärt. Funktionelle Untersuchungen an EWS-FLI1 wurden bisher durch das Fehlen relevanter Modelle und durch die Toxizität des Fusionsproteins in transgenen Systemen behindert . Als Musterbeispiel für eine TET- Genfusion schlagen wir vor, den EWS-FLI1 Pathway direkt in Ewing Sarkomzellen zu studieren. EWS-FLI1 und seine Partner Proteine hsRPB7, BARD1, U1C, sowie - im weiteren Verlauf des Projektes - möglicherweise übergeordnete (bFGFR, IGFR) und nachgeordnete (BRCA1, CD99, PDGF-C) Komponenten des Pathways sollen mittels der Methode der RNA Interferenz (RNAi) auf post-transkriptioneller Ebene ausgeschaltet werden. Wir wollen synthetische "small inhibitory RNA" (siRNA) für die transiente, und "small hairpin RNA" (shRNA), welche von RNA Pol III abhängigen Expressionsplasmiden exprimiert werden, für die stabile Gensuppression verwenden. Die Auswirkung verminderter Expression der genannten Genprodukte soll auf genotypischer und funktioneller Ebene analysiert und verglichen werden. Die Untersuchungen werden Gene Expression Profiling, Reportergen- und Splicingassays, Zellzyklusanalyse, Apoptose, Differenzierungspotential, und DNA Reparatur umfassen. Wir erwarten, daß diese Studien die komplexen Zusammenhänge innerhalb des EWS-FLI1 Pathways erhellen und essentielle Komponenten sowie potentielle therapeutische Targets identifizieren werden. Da siRNA als zukünftige "smart drug" in der Medizin diskutiert wird, werden unsere Resultate das Wissen um das therapeutische Potential von RNAi-basierenden Behandlungsstrategien und über Mechanismen möglicher Resistenz dagegen vermehren.

Das Ewings Sarkom ist der zweithäufigste Knochentumor des Kindes- und Jugendalters. Es ist durch eine Chromosomenumlagerung gekennzeichnet, die zur Fusion zweier unverwandter Gene führt, EWS und FLI1, wodurch ein chimäres Gen mit völlig neuen Eigenschaften entsteht (EWS-FLI1). Ist die spezifische Chromosomenumlagerung vorhanden, so findet sich an der Oberfläche der Tumorzellen auch immer ein Protein mit bisher weitgehend unbekannter Funktion, CD99. Dieser Befund weist auf eine funktionelle Abhängigkeit der beiden molekularen Charakteristika, die einen besonderen diagnostischen Stellenwert für Ewings Sarkome genießen, hin. Das Ursprungsgewebe für das Ewings Sarkom ist unbekannt. Führt man EWS-FLI1 in normale menschliche Zellen ein, so aktiviert es ein zentrales Überwachungsgen, p53, das zum Wachstumsstopp oder sogar Tod der Zellen führt. Paradoxer Weise tolerieren mehr als 90% aller Ewings Sarkome die Anwesenheit von p53, was auf das Vorhandensein eines Schutzmechanismus vor der toxischen Wirkung von EWS-FLI1 in den Tumorzellen hinweist. Deshalb ist das relevanteste Modell zum Studium der onkogenen Funktion des chimären Gens die Ewings Sarkomzelle selbst. Um die Bedeutung von EWS-FLI1 für das fortgesetzte Wachstum von Ewings Sarkomen zu studieren, haben wir uns entschieden, seine Expression in 6 Ewings Sarkomzelllinien unter Nutzung eines evolutionär konservierten Mechanismus der RNA-vermittelten Genrepression zu unterdrücken. Dieser Mechanismus wird RNA Interferenz (RNAi) genannt und basiert auf der Einführung von kleinen, doppelsträngigen, genspezifischen RNA Molekülen. Durch Vergleich des generellen Genexpressionsmusters in An- und Abwesenheit von EWS-FLI1 studierten wir die funktionelle Bedeutung der Genfusion für die Tumorzellen. Außerdem adaptierten wir die Methode der Chromatin Immunpräzipitation, um uns in die Lage zu versetzen, in Tumorzellen direkt EWS-FLI1-gebundene Gene zu isolieren, um damit Mediatoren der onkogenen Wirkung des Fusionsgenproduktes zu identifizieren. Durch eine Kombination dieser Methoden war es uns möglich, einen völlig neuen Mechanismus der p53 Kontrolle in Ewings Sarkomzellen zu entdecken und im Detail zu studieren. Unsere Resultate zeigten, dass EWS-FLI1 durch Unterdrückung eines in der normalen Gewebsentwicklung wichtigen Mechanismus, des NOTCH Signalübertragungsweges, die p53 Aktivierung und damit einen Wachstumsstopp verhindert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der Ursprungszelltyp des Ewings Sarkoms wahrscheinlich eine ruhende Zelle mit aktivem NOTCH Signalweg und erhöhtem p53 Basalspiegel ist. Wir identifizierten weiters 99 direkt von EWS-FLI1 regulierte Gene, wovon für eines, MK-STYX, der Regulationsmechanismus im Detail charakterisiert wurde. Außerdem fanden wir, dass obwohl die CD99 Expression von EWS-FLI1 beeinflusst wird, hohe Expression dieses Proteins eine für die Krankheitsentwicklung unabhängig notwendige Eigenschaft ist. Unterdrückung der CD99 Bildung führte zum Verlust der Tumorbildung im Mausmodel und der für die Metastasierung notwendigen Wanderungsfähigkeit der Tumorzellen. Es gelang uns über einen RNAi-Ansatz ein wichtiges von CD99 unterdrücktes Gen zu identifizieren, KCMF1, welches für die regulatorische Funktion von CD99 für die Tumorzellmigration mitverantwortlich ist. So konnten durch unsere Studie wichtige neue Erkenntnisse über die Eigenschaft der Urprungszelle, und die Mechanismen der Wachstumsregulation und Metastasierung von Ewings Sarkomen gewonnen werden.