Der Carboxylterminus des A1-Adenosinrezeptors

Zusätzlich zu den heterotrimeren G Proteinen spielen akzessorische Proteine eine Rolle in der Rezeptor- vermittelten Signalgebung. Entsprechend bestehender Strukturmodelle gibt es an den zytoplasmatischen Rezeptordomänen G Protein gekoppelter Rezeptoren wenig Raum für Interaktion mit zusätzlichen Bindungspartnern. Eine Ausnahme stellt die carboxyl-terminale Domäne dar, die in ihrem peripheren Anteil von höchst unterschiedlicher Länge und Struktur ist; die Annahme scheint legitim, dass der Carboxyterminus individuelle Eigenschaften eines Rezeptors determiniert und zwar unabhängig von der G-Proteinkopplung. Tatsächlich gibt es bereits einige Beispiele für akzessorische Bindungspartner, die durch Angriff am Carboxyterminus Signalgebung, Regulation und Lokalisation des Rezeptors beeinflussen. In dem beantragten Projekt soll die Hypothese geprüft werden, dass auch im A1-Adenosinrezeptor, einer Minimalvariante G-Protein gekoppelter Rezeptoren, der Carboxyterminus für die Wechselwirkung mit akzessorischen Komponenten zur Verfügung steht. Unsere präliminären Experimente habe gezeigt, dass erstens der Carboxyterminus für die Oberflächenexpression des Rezeptors essentiell ist und zweitens die Affinität für das nachgeschaltete G-Protein und somit die Effizienz der Signalgebung reguliert. Wir haben eine Genbank nach Genprodukten mit Affinität für den A1-Rezeptor Carboxyterminus durchsucht und zwei Klone isoliert. DRiP78 ist ein Protein im endoplasmatischen Retikulum, das für den Export von G-Protein gekoppelten Rezeptoren verantwortlich sein dürfte: anhand dieses Bindungspartners soll am A1-Rezeptor geprüft werden, ob die Faltung der Peptidkette ausreichend und bestimmend für die Oberflächenexpression des Rezeptors ist. Weiters soll untersucht werden, ob Astrin, ein mit Microtubuli-assoziiertes Protein (Klon 2), an der diskreten Lokalisation des A1-Rezeptors in Nervenzellen beteiligt ist. Ferner werden wir die Signalgebung (Effizienz und Effektorselektivität) in Abhängigkeit von der Integrität des Carboxyterminus und der Gegenwart akzessorischer Komponenten testen.

Rezeptoren aus der Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren stehen mit akzessorischen Proteinen in Wechselwirkung, die Signalgebung, Lokalisation und Regulation des Rezeptors individuell steuern. Punktmutationen in der Aminosäuresequenz des A1 -Adenosinrezeptors erzeugen Rezeptorvarianten, die nicht exportiert sondern am Ort ihrer Synthese, dem endoplasmatischen Reticulum zurückgehalten werden. Diese Rezeptorvarianten stellen ein Modell dar für die grundlegende Untersuchung von Störungen, die durch aberrante Retention von ansonst funktionell intakten Plasmaproteinen verursacht werden (z.B. zystische Fibrose bei der in vielen Fällen der "cystic fibrosis transmembrane regulator" im Export zur Zelloberfläche behindert wird und zwar infolge einer diskreten Änderung der Peptidsequenz). Die Fehlsteuerung der A1 -Rezeptorvarianten kann durch Behandlung mit Zell-permeablen Rezeptorliganden behoben werden. Diese Liganden (= "Pharmacochaperone") unterstützen den Rezeptor dabei, die Barriere am "Ausgang" des endoplasmatischen Reticulums zu überwinden. Das Wirkungsprinzip der Pharmacochaperone ist unzureichend beschrieben. Wir haben unsere Forschung darauf konzentriert die involvierten zellulären Mechanismen bei der intrazellulären Retention und deren Überwindung zu untersuchen. Unsere wichtigsten Befunde waren wie folgt: 1. Pharmacochaperone binden an Zwischenstufen des reifenden Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum. Die Bindung dieses Liganden induziert die Ausfuhr von Rezeptormolekülen aus dem endoplasmatischen Retikulum gefolgt von deren Transfer an die Zelloberfläche. Alle Rezeptorvarianten sind funktionell intakt, sobald sie an der Oberfläche angekommen sind. 2. Der hauptsächliche Grund für die Retention ist wahrscheinlich kein Faltungsproblem; Pharmacochaperones wirken nicht als "Faltungsgerüst". Daher gibt es in einem bakteriellen Organismus, der über kein endoplasmatisches Retikulum verfügt, und wo der Rezeptor direkt in die Plasmamembran inseriert wird, keine Steigerung des Expressionsniveaus durch Pharmacochaperone. 3. Vielmehr dürfte in eukaryonten Zellen der Effekt von Pharmacochaperonen durch verminderte Retention vermittels akzessorischer Proteine zustande kommen. Diese Proteinkomponenten zählen zur Qualitätskontrolle am Ausgang des endoplasmatischen Retikulums. Eines dieser Proteine ist DriP78 (dopamine receptor interacting protein 78), das im Vergleich zum Wildtyprezeptor präferentiell an den mutanten A 1 -Rezeptor bindet und dessen Überexpression den Effekt des Pharmacochaperons antagonisiert. Das pharmakologische Prinzip, das aus unseren Experimenten (die dank Unterstützung durch den FWF P16083 durchgeführt werden konnten) hervorgeht, ist dass es möglich ist, die Konformation retinierter Plasmaproteine durch Pharmacochaperone soweit zu korrigieren, dass die Erkennung durch Effektoren der Qualitätskontrolle ab- und der Auswärtstransport zunimmt. Das Prinzip der "Pharmacochaperone" ist deshalb eine potentielle Anwendungsform der Phamakotherapie.