Das Endothel-Transkriptom im diabetischen Milieu

Die diabetische Nephropathie stellt eine der häufigsten Ursachen einer terminalen Niereninsuffizienz dar. Welche Mechanismen zu den seit Jahren bekannten typischen histologischen Veränderungen in der Niere führen ist jedoch heute noch nicht in Detail geklärt. Der Grund dafür liegt in der komplizierten Struktur des Nephrons. Besonders schwierig ist es die in vivo Verhältnisse zwischen glomerulären Endothelzellen -EZ-, Mesangialzellen, Podozyten, der glomerulären Basalmembran und Umfeldfaktoren, wie z.B. Blutflussgeschwindigkeit, in vitro zu imitieren. Das Ziel dieser Studie ist die Gene zu definieren, die potentiell eine pathogenetische Rolle bei der Entstehung der diabetischen Nephropathie spielen. Als Ansatzpunkt dient die Interaktion zwischen EZ und "advanced glycation endproduct -AGE-". AGE beschreibt eine Reihe post-translationeller Veränderungen von Lipiden, Nukleinsäuren und Proteinen, die auf eine nicht reversible, nicht -enzymatische Glykosilierung der Amino-Gruppen durch einen langfristig erhöhten Glukosespiegel in der Zirkulation, vor allem, der diabetischen Individuen zurückzuführen ist. Diese AGE-modifizierten Moleküle werden von AGE-Rezeptoren erkannt, die unter anderem auf EZ exprimiert werden. Die EZ sind unter ständigem Einfluss von "shear stress ", welches eine Funktion der Blutfluss- Geschwindigkeit darstellt. Shear stress wird von drei Parametern (Gefässradius, Flussgeschwindigkeit und Viskosität) bestimmt, von denen der Gefässradius im Vordergrund steht, sodass shear stress in kleineren Gefässen wie glomerulären Kapillaren deutlich erhöht ist. In der Literatur wird immer häufiger über Wirkungen von shear stress auf die EZ berichtet, wobei bezüglich der Wirkmechanismen keine Einigkeit besteht. In dieser Studie wird shear stress herangezogen, einerseits um diese Wirkmechanismen zu klären, andererseits um das in vivo Umfeld der EZ zu imitieren. Als Methode wird "serial analysis of gene expression -SAGE-" angewendet. Mit dieser Methode werden Transcripte in den glomerulären EZ, die unter einem ständigen im Ausmass von dem in den glomerulären Kapillaren zu registrierenden shear stress-Einfluss stehen, quantitativ erfasst. Durch den Vergleich der Transkripte in den EZ, die auf einem normalen Fibronektin gezüchtet wurden, mit denen, die auf AGE- modifiziertem Fibronektin als ein Modell für eine "diabetische glomeruläre Basalmembran" kultiviert wurden, werden die Gene identifiziert, die potentiell in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie involviert sind.

Die Endothelzellen bilden die innerste Zellschicht aller Blutgefäße. Sie sind somit die einzigen Zellen, die der mechanischen Wirkung des Blutstromes ausgesetzt sind. Diese mechanische Größe wird "shear stress" genannt und wird durch Gefäßradius, Flussgeschwindigkeit und Viskosität bestimmt. Obwohl hoher shear stress bei vielen physiologisch wichtigen Prozessen, wie Gefässneubildungen oder Endothelzelldifferenzierung, aber auch bei pathologischen Änderungen, die zu einer Endotheldysfunktion führen können, eine wichtige Rolle spielt, fehlt eine systematische Untersuchung der Genexpression in Endothelzellen nach Applikation von Langzeit-shear stress. Daten einer solchen detaillierten Genexpressionsanalyse waren bislang für Endothelzellen unter "diabetischen" Bedingungen auch nicht erhältlich. In diesem Projekt wurde die Kultivierung von Endothelzellen auf einem Matrixprotein (Fibronektin), welches durch eine längere Inkubation mit Zucker in seiner Struktur verändert wurde, als "diabetisches Milieu" definiert. Diese Moleküle, die durch erhöhte Zuckerkonzentration sich auf nicht- reversible Weise verändern, werden "advanced glycation endproducts (AGE)" genannt; in diesem Fall ein AGE- modifiziertes Fibronektin (AGE-FN). In diesem Forschunsprojekt wurden Transkriptlisten in 3 Gruppen von mikrovaskulären Endothelzellen, die in künstlichen Kapillargefässen kultiviert wurden, mittels "serial analysis of gene expression" (SAGE), generiert. SAGE war die Methode der Wahl, da mit dieser Methode Expressionen von bekannten sowie unbekannten Transcripten quantitativ dargestellt und unter verschiedenen Zellgruppen verglichen werden können. Jedes dieser 3 SAGE-libraries wurde von The National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) angenommen und erhielt eine Identifikationsnummer (GSM): Mikrovaskuläre Endothelzellen auf nativem Fibronektin unter hohem shear stress (17 dyn/cm2 ) für 10 Tage: 30, 615 Transcripte (GSM32266). Mikrovaskuläre Endothelzellen auf nativem Fibronektin unter niedrigem shear stress (0.7 dyn/cm2 ) für 10 Tage: 31,141 Transcripte (GSM41248). Mikrovaskuläre Endothelzellen auf AGE- Fibronektin unter hohem shear stress (17 dyn/cm2 ) für 10 Tage: 30,870 Transcripte (GSM45608). Durch den Vergleich dieser Transkriptlisten mittels einer speziell für dieses Projekt geschriebenen Software konnten Gene identifiziert werden, die für Endothelzellen unter hohem shear stress beziehungsweise im diabetischen Milieu spezifisch erscheinen. Im Moment laufen Experimente zur Bestätigung dieser Ergebnisse in vivo.