Regulation der Cellulasebildung durch Laktose

Lactose, das Hauptkohlenhydrat der Molke, einem Nebenprodukt der Käseherstellung, stellt eine erneuerbare Kohlenhydratquelle dar, welche als C-Substrat für eine Anzahl von Fermentationsprozessen verwendet wird. Im Falle der Produktion von Cellulasen oder rekombinanten Proteinen durch Trichoderma reesei ist sie ggw. die einzige ökonomisch verfügbare lösliche Kohlenstoffquelle. Leider aber ermöglicht Lactose nur ein langsames Wachstum des Pilzes, und auch die Ausbeuten an Cellulasen sind niedriger als auf Cellulose. Die Gründe dafür, bzw. die den Laktosemetabolismus und Cellulasebildung auf ihr limitierenden Punkte sind nicht bekannt. Wir haben während der Mitarbeit an einem EU Projekt (EUROFUNG2) in jüngerer Zeit zeigen können daß eine Unterbrechung der Galaktokinase-Reaktion im Laktosestoffwechsel die Cellulaseinduktion durch Laktose fast vollständig unterbindet, und daß die Induktion der Cellulasen vom Funktionieren der an der Induktion durch Cellulose beteiligten DNA-bindenden Proteine unabhängig ist. In diesem Projekt planen wir daher - am Beispiel des cbh2 Promoters aus T. reesei - die Nukleotidmotife welche für die Cellulaseinduktion durch Laktose notwendig sind - zu identifizieren und charakterisieren, sowie die Gene der daran bindenden Regulatorproteine zu klonieren. Weiters wollen wir näher untersuchen, welche Eigenschaft der Galaktokinasereaktion - das Protein selbst oder die Konzentration von Galaktose-1-Phosphat - für das Auslösen der Induktion relevant sind.

Die filamentöse Pilz H. jecorina wird industriell zur Produktion von Enzymen wie Zellulasen und rekombinanten Proteinen eingesetzt, wobei Industriestämme bis zu 100 Gramm Zellulasen pro Liter produzieren. Das Disaccharid Laktose ist ein natürlicher Induzer der Zellulasenbildung und als Abfallprodukt der Milchindustrie eine billige und erneuerbare Kohlenstoffquelle, die daher in Fermentationen für Enzym- und Proteinproduktion verwendet wird. Wir haben daher einen systematischen Ansatz zur Identifizierung der wichtigsten Enzyme und Regulatoren des Laktose Stoffwechsels gewählt, um die Grundlagen für maßgeschneiderte Stämme für die industrielle Produktion von Enzymen zu schaffen. Im Gegensatz zu filamentösen Pilzen, ist der Laktose und Galaktose Katabolismus in den Hefen Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis sehr detailliert studiert worden. Das GAL(LAC) Regulon ist ein Modellsystem für die transkriptionelle Kontrolle und Genregulation in Eukaryonten. Unsere Resultate zeigen dass dieses System auf Hefen beschränkt ist und für Pilze nicht repräsentativ ist. H. jecorina spaltet die Laktose extrazellulär durch eine ß-Galactosidase in die D-Glukose and D-Galaktose. D-Glukose wird über die Glykolyse abgebaut, während die D- Galaktose entweder über den Leloir Weg oder einen von uns neu entdeckten Stoffwechselweg abgebaut wird bevor sie in die Glykolyse eingeschleust wird. Der von uns neu entdeckte zweite Stoffwechselweg für D-Galaktose setzt sich aus verschiedenen Enzymen das L-Arabinose and D-Xylose Abbauweges zusammen. Die Gene des Leloir Weges in Pilzen liegen im Gegensatz zu den Hefen nicht in einem Gencluster, und einem der Enzyme fehlt die wichtige Aldose 1-Epimerase Domäne. Die Leloir Gene werden während des Wachstums konstitutiv exprimiert und durch D-Galaktose aber auch L-Arabinose induziert. In den beiden Hefen ist die Galaktokinase - das erste Enzym des Leloir Weges - ein bifunktionelles Protein, das für die Phosphorylierung der D-Galaktose und für die transkriptionelle Induktion der Leloir Gene verantwortlich ist. Im Gegensatz dazu wird in H. jecorina die Galaktokinase nicht für die Induktion der Leloir Gene gebraucht. Außerdem finden sich in filamentösen Pilzen keine Orthologe des transkriptionellen Hefeaktivators GAL4/LAC9 und unterstützen daher unseren Befund der unterschiedlichen Regulation des Leloir Weges. Der transkriptionelle Aktivator der Zellulasenbildung in H. jecorina ist nicht mit dem Hefe Gal4/Lac9 Aktivatoren verwandt und außerdem essentiell für das Wachstum auf Laktose. Die Induktion der Zellulasen wird durch den transkriptionellen Regulator Xyr1, den beiden ersten Enzymen der zwei D-Galaktose Abbauwege und einem niedrigen ß-Galactosidase Level reguliert.