Wechselwirkung picornaviraler Proteinasen mit eIF4G

Das Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV) ist und bleibt ein ökonomisch wichtiges Tierpathogen aus der Familie der Picornaviren. Seine Replikation ist von der Aktivität dreier viraler Proteinasen abhängig. Eine dieser Proteinasen ist die Leader Proteinase (L pro ). Sie ist eine papain-ähnliche Cysteinproteinase, die einmal am viralen Polyprotein, dem primären Produkt viraler Proteinsynthese, spaltet und weiters zumindest ein zelluläres Protein, den eukaryontischen Initiationsfaktor (eIF) 4G, prozessiert. Dadurch wird die Initiation der Proteinsynthese gecappter mRNA verhindert. Die Synthese von Proteinen viraler mRNA bleibt hingegen unbeeinflusst, da sie keine cap- Struktur benötigt. Eine ähnliche Spaltreaktion findet auch bei anderen Vertretern der Picornavirusfamilie, wie z. B. dem humanen Rhinovirus (HRV) oder Poliovirus, statt. Hier führt jedoch eine chymotrypsin-ähnliche Proteinase (2Apro ) die eIF4G-Spaltung durch. In dem beschriebenen Projekt sollen biochemische und strukturbiologische Ansätze entwickelt werden, um die Interaktion der Lpro von MKSV bzw. der 2Apro von HRV mit eIF4G zu charakterisieren. Das Untersuchen und Verstehen dieser Reaktion ist sehr wichtig, da sie einen wichtigen Parameter der Virulenz in MKSV und Swine Vesikular Disease (einem wichtigen Picornavirus beim Schwein) darstellt. Zusätzlich sollen proteinchemische und zellbiologische Experimente entwickelt werden, um nach weiteren zellulären Substraten von Lpro zu suchen und ihre Beziehung zu Vorgängen in der Wirtszelle während der Replikation von MKSV festzustellen. Die angegebenen Experimente basieren auf Systemen und Ergebnissen, die aus dem vorigen Projekt P-13367 gewonnen wurden. 4 grundlegende Durchbrüche konnten in diesem Projekt erzielt werden. Erstens wurde die dreidimensionale Struktur der Lpro auf 1.9 Å bestimmt. Zweitens wurde ein effizientes System mit Hilfe von Retikulozytenlysat entwickelt, mit dem es möglich ist, die eIF4G-Spaltung mit Konzentrationen der Lpro bzw. 2Apro Proteinasen durchzuführen, die denen bei einer Infektion in vivo ähnlich sind. Dieses System wurde in weiterer Folge dazu verwendet, um zu zeigen, dass die aus 18 Aminosäuren bestehenden C-terminale Extension (CTE) der Lpro , obwohl sie sich nicht in der Nähe des aktiven Zentrums befindet, nötig ist, um eIF4G zu spalten. Schliesslich konnte noch eine direkte Interaktion der Lpro und 2Apro mit einer Region auf eIF4G in der Nähe der Spaltstelle nachgewiesen werden, die im Falle von Lpro auch die CTE involvierte. Eine Information bezüglich der Bindungsstelle von eIF4G an 2Apro konnte noch nicht gewonnen werden. Das ist nur eine der vielen offenen Fragen betreffend der Wechselwirkung picornaviraler Proteinasen und eIF4G. Ziel des Projekts ist es, diese Fragen zu untersuchen, indem definierte Mutationen in Regionen der Lpro bzw. 2Apro von denen angenommen wird, dass sie mit eIF4G interagieren, eingefügt werden,. Im Falle der Lpro werden die Mutationsstudien durch NMR Spektroskopie ergänzt. Diese strukturellen Untersuchungen werden sich auf mögliche Strukturen der flexiblen CTE der Lpro beziehen und werden ausserdem dazu eingesetzt werden, um die Wechselwirkung von Lpro mit Oligopeptiden, bestehend aus der Spaltstelle am viralen Polyprotein bzw. auf eIF4G, festzustellen. Das Verständnis der 2Apro von HRV ist aufgrund der bekannten Unterschiede in der Substratspezifität von HRV Serotyp 2 und 14 schwierig. Mutationsstudien und strukturelle Ansätze (mit Hilfe von X-ray Kristallographie) sollen entwickelt werden, um den Grund für diese Unterschiede festzustellen und um Regionen am 2A pro Molekül zu definieren, die für die Interaktion mit dem Substrat eIF4G von Bedeutung sind.

Das Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV) ist und bleibt ein ökonomisch wichtiges Tierpathogen aus der Familie der Picornaviren. Seine Replikation ist von der Aktivität dreier viraler Proteinasen abhängig. Eine dieser Proteinasen ist die Leader Proteinase (L pro ). Sie ist eine papain-ähnliche Cysteinproteinase, die einmal am viralen Polyprotein, dem primären Produkt viraler Proteinsynthese, spaltet und weiters zumindest ein zelluläres Protein, den eukaryontischen Initiationsfaktor (eIF) 4G, prozessiert. Dadurch wird die Initiation der Proteinsynthese gecappter mRNA verhindert. Die Synthese von Proteinen viraler mRNA bleibt hingegen unbeeinflusst, da sie keine cap- Struktur benötigt. Eine ähnliche Spaltreaktion findet auch bei anderen Vertretern der Picornavirusfamilie, wie z. B. dem humanen Rhinovirus (HRV) oder Poliovirus, statt. Hier führt jedoch eine chymotrypsin-ähnliche Proteinase (2Apro ) die eIF4G-Spaltung durch. In diesem Projekt setzten wir biochemische und strukturbiologische Ansätze ein, um die Interaktion der Lpro von MKSV bzw. der 2A pro von HRV mit eIF4G zu charakterisieren. Das Untersuchen und Verstehen dieser Reaktion ist sehr wichtig, da sie einen wichtigen Parameter der Virulenz in MKSV und Swine Vesikular Disease (einem wichtigen Picornavirus beim Schwein) darstellt. Zusätzlich wurden proteinchemische und zellbiologische Experimente entwickelt, in einem Versuch weitere zelluläre Substraten von Lpro zu identifiziern und ihre Beziehung zu Vorgängen in der Wirtszelle während der Replikation von MKSV festzustellen. In diesem Projekt haben wir die molekulare Struktur der viralen Proteinasen verwendet um zu verstehen, wie sie aufgebaut sind, wie sie ihre Funktionen ausüben und wie sie zelluläre Proteine erkennen und sie modifizieren. Überraschenderweise haben die Proteine von MKSV und von HRV verschiedene Mechanismen entwickelt, wie sie virale und zelluläre Proteine erkennen. Zum Beispiel zeigten wir, daß im Falle der MKSV Lpro andere Aminosäurereste an der Bindung von eIF4G beteilgt sind, als jene, die das virale Protein erkennen. Zusätzlich fanden wir heraus, dass die Proteinasen verschiedener HRV Serotypen zelluläre Proteine auf verscheidene Weise erkennen. Viren, die die gleiche Krankheit verursachen, können also andere Wechselwirkungen mit der Wirtszelle haben. Diese Ergebnisse helfen uns, die Mechanismen zu verstehen, die diese zwei unterschiedlichen Proteinasen entwickelt haben, um Moleküle der Wirtszelle zu ändern. Solche Befunde bilden ein Teil des grösseren Rätsels, wie diese Viren, die für höchstens 14 reife Proteine kodieren, eine viel komplexere Säugetierzelle verändern können, so dass sie nach nur wenigen Stunden in eine Virus produzierende Fabrik umgeschaltet wird.