Die Rolle von PCI in Fertilität

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein unspezifischer, Heparin-bindender Serine Protease Inhibitor (Serpin), der mit einer Reihe von plasmatischen und extravaskulären Serinproteasen enzymatisch inaktive, stabile 1:1-Komplexe bildet. PCI hemmt aktiviertes Protein C (APC), die Plasminogenaktivatoren Urokinase (uPA) und Gewebeplasminogenaktivator (tPA), und die Spermienprotease Acrosin. Humaner PCI ist ein Plasma Protein, kommt aber auch in anderen Organen, insbesondere im Reproduktionstrakt vor. Die Co-Lokalisation von hohen PCI-Konzentrationen mit einigen seiner Zielproteasen in männlichen Reproduktionsorganen deuten auf eine Rolle von PCI in der Reproduktion hin. Im Rahmen eines vorherigen FWF-Projektes (P13452-BIO) haben wir transgene Mäuse mit fehlenden PCI etabliert (PCI -/- Mäuse). Die PCI-/- Mäuse waren offenbar gesund, aber die männlichen Mäuse waren unfruchtbar. Die Sertoli-Zell-Barriere in diesen Mäusen war zerstört and die Spermatogenese war abnormal. Die resultierenden Spermien waren missgebildet und morphologisch ähnlich wie die abnormalen Spermien in manchen Fällen von humaner männlicher Infertilität. Im Rahmen des vorgeschlagenes Projekts möchten wir die Ursachen dieser Infertilität weiter klären. Zur Untersuchung der Möglichkeit, dass die bemerkten Veränderungen in den PCI-/- Mäusen durch die ungehemmte proteolytische Aktivität verursacht wurden, sollen im vorliegenden Projekt die transgenen Doppel-knockout Mäuse (PCI und jeweils eine Ziel-Protease, z.B. uPA, tPA oder Akrosin) etabliert werden. Diese Mäuse werden hinsichtlich Fertilität analysiert und die Organe des Reproduktionstraktes werden bezüglich der Morphologie und der proteolytischen Aktivität untersucht. Zusätzlich wird die genaue Lokalisierung von PCI in männlichen Reproduktionsorganen der Wild-Typ-Tiere immunohistochemisch untersucht. Zieht man eine Zerstörung der Blut-Hoden-Schranke von PCI-knockout Mäusen in Betracht, so sollten männliche PCI-knockout Mäuse auf An- oder Abwesenheit von Anti-Spermien Antikörpern untersucht werden. Zusätzlich werden weitere Formen von PCI (aktiv, gespalten, mit Proteasen Komplexe bildend) in den Hoden analysiert werden. Eine Analyse der Interaktion von Keimzellen mit Sertoli Zellen ex vivo sollte durchgeführt werden, um den Mechanismus, der für die Zerstörung der Sertoli-Zell-Barriere und die Zerstörung der Sertoli-Zell-Keimzell-Verbindung in PCI-knockout Mäusen verantwortlich ist, zu analysieren. Eine erfolgreiche Durchführung dieses Projekts sollte neue Erkenntnisse über den Mechanismus der männlichen Infertilität im Zusammenhang mit PCI-Mangel liefern. Wir glauben, dass das Ergebnis dieser Studie für eine weitere Analyse der molekularen Grundlagen menschlicher Infertilität einer beträchtlichen Population infertiler Patienten in der Zukunft relevant sein könnte.

Viele physiologische Prozesse laufen sowohl in murinen als auch in menschlichen Körper ähnlich ab. Daher ist das Mausmodell ein bewährtes Hilfsmittel in der humanen Physiologie und Pathologie. Die Anwendung der Embryonal-Stammzelltechnologie (ES) ermöglicht spezifische Gene in Mäusen zu desaktivieren, wodurch auch wichtige Informationen über die Funktion dieser Gene im menschlichen Körper gewonnen werden. Vor kurzem generierten wir Mäuse mit fehlenden PCI-Genen (PCI Knockout-Mäuse, PCI-/- Mäuse). Solche Mäuse sind zwar gesund, aber die Männchen dieses Genotyps sind unfruchtbar. Wie wir zeigen konnten, wird die Unfruchtbarkeit dieser Mäuse offensichtlich durch eine gestörte Entwicklung der Spermien, die durch eine Zerstörung der Blut-Hoden Zell Barriere verursacht wird. Diese Zerstörung könnte eventuell durch unkontrollierte proteolytische Aktivität im Hoden erfolgen. Diese Ergebnisse sind identisch mit früheren Studien, die zeigten, dass sowohl die Ansammlung als auch die Zerstreuung von Sertoli-Zellen (Stütz-Zellen in der Basalmembran des Hodens) an der vorübergehenden Aktivierung von Proteasen (wie z.B. Urokinase (uPA), Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Protease- Inhibitoren) im Hoden beteiligt sind. Die Aktivitäten dieser Proteasen und deren Inhibitoren im Hoden müssen koordiniert werden um die Funktion der Blut-Hoden-Barriere aufrechtzuerhalten. Deshalb generierten wir Doppel-Knockout-Mäuse mit fehlendem PCI, uPA und tPA und analysierten sie im Detail. Wir fanden heraus, dass das Fehlen von uPA oder tPA die Fruchtbarkeit von PCI-/- Männchen nicht wiederherstellt. Zusätzlich wurde durch histologische Analysen geklärt, dass PCI während der Embryonalentwicklung nicht im Hoden aufscheint (im Gegensatz zu erwachsenen Mäusen). Wir konnten aber die Expression von PCI in verschiedenen Entwicklungsstadien von postnatelen wild-typ Mäusen zeigen und konnten daraus schließen, daß die beobachteten morphologischen Veränderungen im Hoden und in den Spermien in den PCI-Knockout-Mäusen in den entsprechenden Entwicklungsstadien mit PCI zusammenhängen. Es wurde ebenso subzellulär die Lokalisation von PCI-Antigenen in den männlichen Fortpflanzungsorganen von Wild-typ-Mäusen bestimmt. Das Muster der PCI-Expressionen ließ auf eine Verbindung zwischen der Migration von spermatogenen Zellen in den Basal- Bereich (z.B. wo die Blut-Hoden-Barriere angesiedelt ist) und der Reifung der Spermazellen in dem apikalen Teil der Wände von seminiferen Tuben vermuten. Zusammenfassend ist das generierte Tiermodel von großer Bedeutung, um humane Unfruchtbarkeit auf molekularer Basis zu analysieren und die Rolle von PCI bei der humanen Fortpflanzung zu klären. In der Folge könnte dies zur Entwicklung von neuen Strategien bei der Behandlung humaner Unfruchtbarkeit führen.