Hefe-Biodiversität im Verdauungstrakt von Insekten

Im vorliegenden Projekt wird die Biodiversität von Hefen und dimorphen Pilzen im Verdauungstrakt von Insekten untersucht. Veröffentlichungen zeigten, dass in diesem Milieu eine große Artenvielfalt vorliegt wobei auch neue Arten oder sogar neue Gattungen vorkommen. Dieses Projekt konzentriert sich auf eine spezielle Gruppe von Insekten, nämlich auf Schädlinge, die im Fusarium - infizierten Getreide vorkommen. Da diese Schädlinge über längere Zeit Kontakt mit Pilz-kontaminierten Getreide hatten, kann erwartet werden, dass sich in ihrem Darm Symbiosen mit Mycotoxin-inaktivierenden Mikroorganismen entwickelt haben. Aufgrund der Tatsache, dass mindestens 25% des weltweit kultivierten Getreides mit Schimmelpilzgiften kontaminiert sind (FAO, Food Outlook 1996, 5/6), ist es notwendig, Entgiftungsmöglichkeiten zu finden, um Menschen und Tiere vor den krebserregenden, immunsuppressiven und genotoxischen Effekten dieser Mykotoxine zu schützen. In weiteren Projekten können isolierte, Mykotoxin-transformierende Stämme zur Entwicklung Mykotoxin-inaktivierender Futtermittelzusätze verwendet werden oder als Quelle für die Isolierung der Gensequenzen der entsprechenden Enzyme dienen, welche in das Pflanzengenom geklont werden können, um eine Akkumulation der Toxine zu verhindern. Im Rahmen dieses Projektes wird die Biodiversität von Hefearten folgendermaßen untersucht: Einerseits wird - ohne Kultivierung - die DGGE-Methode (denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese) einen Überblick über die Zusammensetzung der gesamten Hefepopulation liefern (kultivierbare und nicht kultivierbare Stämme). Andererseits werden - nach einem Kultivierungsschritt - werden genotypische Charakterisierungsmethoden (Bestimmung ribosomaler Gensequenzen, "RAPD-PCR") angewendet. Traditionelle morphologische und physiologische Charakterisierungsverfahren werden nur im Falle neuer Speziesbeschreibungen zum Einsatz kommen. Für die DGGE-Methode wird die ITS 1-2 Region der rDNA mit Pilz-spezifischen Primer amplifiziert. Die Zufallsprimer abhängige Polymerase Kettenreaktion ("RAPD-PCR") kann zur Unterscheidung der verschiedenen Arten gleich nach der Isolierung und zur Bestätigung der Identifizierungsergebnisse aufgrund der 26S rDNA-Gene herangezogen werden. Für Euascomyceten wird zusätzlich eine partielle Sequenzierung der 18S rDNA durchgeführt. In einigen Fällen wird die Gesamtsequenz erforderlich sein, um phylogenetische Studien durchführen zu können. Mit dieser Strategie wird es auch möglich sein, Fragestellungen, wie etwa die Entwicklung von Symbiosen oder die Änderung der Intestinalflora während der verschiedenen Entwicklungsstadien der Insekten, zu beantworten. Schließlich werden die Stämme noch hinsichtlich Mykotoxin-abbauender Eigenschaften untersucht.

Aus dem Darmtrakt der niederen Termite Mastotermis darwiniensis konnte eine neue Trichosporon Art isoliert werden. Diese neue Trichosporon Art ist in der Lage verschiedene Mycotoxine (Ochratoxin A , Zearalenon) zu detoxifizieren und wurde deshalb T. mycotoxinivorans genannt. In phylogenetischen Stammbäumen der beiden ITS-Regionen und Partialsequenzen der 18S rDNS (600 Basenpaare) bzw. der 26S rDNS (D1/D2-Region) erweist sich T. loubieri als nächst verwandte Art. In der D1/D2 Region der 26S rDNS unterscheiden sich die beiden Trichosporon Arten in 9 Basenpaaren. Die IGS1 Region von T. mycotoxinivorans ist 401 Bp lang von T. loubieri hingegen 430 Bp. Physiologisch unterscheidet sich T. mycotoxinivorans von T. loubieri durch die Fähigkeit zur Assimilation von Inulin und Galaktitol und einem Ausbleiben des Wachstums bei 40C. T. mycotoxinivorans wird als Futtermittelzusatz in der Tierzucht verwendet. Zweiundreißig Metschnikowia Stämme wurden aus gesunden Mais Stengeln sowie aus dem Darm und Kot von 3 Maisschad-Insekten (Helicoverpa armigera, Ostrinia nubialis, Diabrotica virgifera) isoliert. Die Hefe-Isolate wurden über PCR-"fingerprinting", Partialsequenzen der 26S rDNS (D1/D2-Region) und einem 979 Basenpaaren langen Abschnitt des Actin Gens (act-1) charakterisiert.Genotypisch lassen sich die Metschnikowia Isolate 3 Gruppen zuordnen (M. fruticola, M. chrysoperlae, und eine neue Art M. andauensis). M. andauensis (HA 1657T) wird als neue Art beschrieben. Verschieden von M. fructicola und M. pulcherrima läßt sich M. andauensis über das Actin Gen eindeutig abgrenzen. Die beiden Stämme von M. andauensis stammen aus dem Darm der Raupe von Helicoverpa armigera bzw. aus dem Kot der Raupe von Ostrinia nubilalis. Eine neue Cryptococcus Art, C. zeae, wurde isoliert aus gesunden Maispflanzen (3 Stämme) und aus dem Darm der Raupe von Ostrinia nubilalis (2 Stämme) bzw. aus dem Darm des Käfers Diabrotica virgifera (1 Stamm). Über "PCR-fingerprinting" wird die Konspezifität der sechs Stämme nachgewiesen. In phylogenetischen Stammbäumen aus Partialsequenzen der 26S rDNS (D1/D2-Domäne) bzw. der ITS 1- 5.8S- ITS 2 Region erweist sich Cryptococcus luteolus als nächst verwandte Art. Physiologisch unterscheiden sich die beiden Cryptococcus Arten in zwei Tests (L-sorbose, D-Tryptophan). C. zeae assimiliert L-Sorbose, bei C. luteolus ist die Assimilation von L- Sorbose verzögert oder fehlend. Die Stickstoffquelle Tryptophan verwertet C. zeae, C. luteolus zeigt hingegen keinen Abbau. Um auch nicht kultivierbare Hefen zu erfassen wird die Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE) und die Klonierung angewendet. Es werden keine nicht kultivierbaren Hefen gefunden.