Methylierung beim Multiplen Myelom

Beim Multiplen Myelom (MM) handelt es sich um eine lymphoproliferative Erkankung der B-Zellen, die durch die klonale Vermehrung von Plasmazellen im Knochenmark, Osteolysen im Knochen und dem Auftreten von monoklonalem Immunglobulin im Serum und/oder Urin der Patienten charakterisiert ist. Obwohl bereits verschiedene prognostische Parameter inklusive zytogenetischer Veränderungen (im Besonderen Deletionen im chromosomalen Bereich 13q) identifiziert wurden, ist nach wie vor die Pathogenese dieser Erkrankung nicht restlos geklärt. Die aberrante Methylierung der Promoterregion von Tumorsuppressorgenen (TSG) bewirkt, ebenso wie Deletionen und Mutationen, die Inaktivierung dieser Gene. In einer kürzlich publizierten Studie wurde gezeigt, dass die aberrante Methylierung der Gene p15 und p16 bei MM häufig nachgewiesen werden kann. Unsere Hypothese ist deshalb, dass die aberrante Methylierung verschiedener Gene wesentlich an der Pathogenese dieser Erkrankung beteiligt ist. Wir planen nun den Methylierungsstatus der Gene p16, p15, p73, MGMT, CDH1, DAPK, SOCS-1, RARbeta, TIMP-3 und RASSF1A in einer grossen Anzahl von Patienten mit MM (N=150) mittels der methylierungsspezifischen PCR zu bestimmen. Alle diese Gene sind in die Entstehung verschiedener maligner Erkrankungen involviert, weshalb die Vermutung nahe liegt, dass diese Gene auch in der Pathogenese von MM eine wesentliche Rolle spielen. Die Methylierungsergebnisse werden mit verschiedenen chromosomalen Veränderungen und klinisch-pathologischen Charakteristika der Patienten verglichen. Zusätzlich soll untersucht werden, ob es sich bei der aberranten Methylierung um eine frühe Veränderung handelt, die bereits bei der monoklonalen Gammopathie nachgewiesen werden kann. Die Ergebnisse dieses Projektes sollen die Bedeutung der aberranten Methylierung verschiedener Gene für die Entstehung von MM klären und können potentiell für die Entwicklung neuer Therapiestrategien für Patienten mit MM von entscheidender Bedeutung sein.

Bei verschiedenen malignen Erkrankungen wurde die aberrante DNA Methylierung (nachfolgend als Methylierung bezeichnet) als häufig auftretender Mechanismus zur Inaktivierung tumor-assoziierter Gene identifiziert. Da über den Methylierungsstatus von Tumorsuppressorgenen bei monoklonalen Gammopathien nur wenig bekannt war, haben wir die Gene p16, TIMP3, p15, CDH1, DAPK, p73, RASSF1A, p14, MGMT und RARß mittels Methylierungs-spezifischer PCR bei Patienten mit monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) und Multiplem Myelom (MM) bestimmt. Mindestens 1 Gen war in 79% der MGUS Patienten und in 80% der MM Patienten methyliert. Häufig methylierte Gene bei MGUS Patienten waren p16 (28%), TIMP3 (35%), DAPK (17%) und p73 (21%). Bei MM Patienten waren am häufigsten die Gene p16 (36%), TIMP3 (29%), p15 (27%), CDH1 (27%) and DAPK (22%) methyliert. Interessanterweise war CDH1 bei MM Patienten, nicht aber bei MGUS Patienten methyliert, was den Schluss zulässt, dass die CDH1 Methylierung ein Marker für eine Krankheitsprogression sein könnte. Um die Bedeutung epigenetischer Veränderungen beim MM besser zu verstehen, haben wir mittels Microarray-Analysen eine genom-weite Analyse von durch epigenetische Mechanismen regulierten Genen durchgeführt. Dabei wurde die Genexpression in unbehandelten, mit einer demethylierenden Substanz (5-Aza-2-Deoxycytidine; Aza-dC) und/oder einem Histondeazetylierungs-Inhibitor (Trichostatin A; TSA) behandelten MM Zelllinien untersucht und die Ergebnisse untereinander verglichen. Es konnten nach Behandlung mit Aza-dC 282 Gene, nach Behandlung mit TSA 343 Gene und nach Aza-dC/TSA Behandlung 470 Gene identifiziert werden, deren Expression in mindestens 1 Zelllinie hoch-reguliert wurde. Dabei konnte eine Vielzahl von Genen identifiziert werden, die in Regulation von Immunantwort, Zellproliferation, Signaltransduktion, Apoptose und Zellzyklus involviert sind. Die bereits bekannte epigenetische Regulation einiger Gene (u.a. TIMP1, CDKN1A, SOCS1 und CDH1) wurde dabei bestätigt. Weitaus wesentlicher ist jedoch, dass eine große Anzahl an tumor-assoziierten Genen identifiziert wurde, deren epigenetische Inaktivierung beim MM bis dato unbekannt war (u.a. ING1p33, TADA3L, BTG1, JUP, NGFRAP1 and CGREF1). Aus diesem Pool wurden bisher 5 Gene (CPEB1, CD9, GADD45G, AKAP12a und GJA1) für Methylierungsanalysen bei MM Zelllinien, MGUS Proben und Knochenmarkproben von MM Patienten ausgewählt. Die Methylierungsfrequenz dieser Gene beträgt zwischen 17% und 50% in MM Zelllinien und zwischen 13% und 50% in MM Proben. Zumindest ein Gen war in 70% der MM Proben methyliert. Die Methylierung dieser Gene wurde häufiger in MM Patienten als in MGUS Patienten gefunden. Dieser Unterschied war im Fall von CPEB1 und GADD45G statistisch signifikant. Unsere Daten zeigen, dass die Methylierung ein häufiges Ereignis in der Pathogenese des MM ist. Neben einem besseren Verständnis der Entstehung von MGUS und MM können unsere Ergebnisse potentiell zur Entwicklung neuer Strategien in der Therapie von MM Patienten beitragen.