Zell-Modelle für die Untersuchung von Ca2+ Kanalmutanten

In früheren Studien wurde von uns ein Zellkultursystem entwickelt, das Struktur-Funktions-Untersuchungen von genetisch veränderten Kalziumkanälen in ihrer natürlichen zellulären Umgebung ermöglichte. Dieses System erwies sich bei der Aufklärung der Rolle von Kalziumkanälen in der Steuerung der Muskelkontraktion als außerordentlich wertvoll. Im vorliegenden Projekt planen wir die Entwicklung weiterer und verbesserter Zellkultursysteme, mit denen wir diese erfolgreiche Forschungsstrategie auf andere Kalziumkanäle, auf Nervenzellen, und auf Untersuchungen von genetischen Erkrankungen ausweiten können. U.a. erwarten wir uns von diesen neuen "homologen Expressionssystemen" einen wichtigen Beitrag zu unseren Untersuchungen an der Erregungs-Kontraktions-Kopplung, bei gleichzeitiger Reduktion der dafür notwendigen Versuchstiere. Unser bewährter experimenteller Ansatz basiert darauf, Zelllinien von Mausmutanten zu erzeugen, denen ein natürlicher Kalziumkanal fehlt und diesen durch rekombinante Kanäle zu ersetzen. Neu ist, dass die Zelllinien durch Kreuzung zweier Mausmutanten (Kalziumkanal-Mutante und ImmortoMouse) hergestellt werden. Die so gewonnenen Zelllinien vereinen die Eigenschaften beider Mäuse und können somit stabil transfiziert und über viele Generationen unverändert vermehrt und untersucht werden. Exprimiert man in diesen Zellen den fehlenden Wildtyp-Kanal, wird so die normale Funktion wieder hergestellt. Exprimiert man stattdessen einen genetisch veränderten Kanal, können die Auswirkungen der Mutation auf die Entwicklung und Funktion der Zellen mit einer breiten Palette von Methoden untersucht werden. Dies gibt uns wichtige Informationen über die Eigenschaften der Kalziumkanäle, über den Mechanismus der Erregungs-Kontraktions-Kopplung, und über die Pathophysiologie von Muskelerkrankungen. Um das volle Potential dieser Kulturen als zelluläre Krankheitsmodelle zu erfassen, sollen zwei Zelllinien mit Kanalmutationen, die beim Menschen zur malignen Hyperthermie führen, erzeugt und in verschiedenen Labors analysiert werden. Weiters soll diese erfolgreiche Forschungsstrategie nun auch in Untersuchungen von Physiologie und Pathophysiologie der Kalziumkanäle in Nervenzellen Anwendung finden.

Ziel dieses Projektes war es, Zellmodelle zur Untersuchung von normalen und mutierten Kalziumkanälen in der natürlichen Umgebung von Muskelzellen zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurden Mausmutanten, denen Kalziumkanäle fehlen, mit der transgenen Immortomaus gepaart, und Muskelzellen gewonnen, welche die Eigenschaften beider Tiermodelle vereinten. Dazu musste zuerst die Position des Immorto-Transgens im Genom der Immortomaus lokalisiert werden und ein PCR Test zur Genotypisierung entwickelt werden (Kern & Flucher, 2005). Insgesamt wurden so mehrere Zelllinien von CaV1.1 und RyR1 Kalziumkanal Null-Mutanten erzeugt, und untersucht, inwieweit heterologe Expression eines gesunden Kanal-Gens die normale Muskelfunktion in diesen Zellen wieder herstellt. Detaillierte Untersuchungen solcher stabil transfizierter Muskelzelllinien zeigten eine unerwartete Klon-zu-Klon Variabilität diverser Zelleigenschaften, die eine zweckmäßige Analyse von Mutationseffekten ausschließt. Andererseits zeigte sich die transiente Transfektion der immortalisierten Zelllinien für solche Studien geeignet (Kugler et al., 2004a, 2004b; Weiss et al., 2004; Takekre et al., 2004; Schuhmeier et al., 2005). Als Alternative zu Untersuchungen von genetisch veränderten Kalziumkanälen in den rekonstituierten Muskelzelllinien testeten wir die Eignung von siRNA Gen-Silencing in Muskelzellen. Diese neue Methode erwies sich besonders wertvoll in der Untersuchung essenzieller Proteine, für welche keine Knock-Out Mausmodelle zur Verfügung stehen. Die siRNA Technik wurde somit erstmalig in unserer Untersuchung der Funktion der Kalziumkanal a 2 d-1 Untereinheit an Muskelzellen eingesetzt (Obermair et al., 2004, 2005; Tuluc et al., 2007). Expression der Herz-Variante des Kalziumkanals in unseren Skelettmuskel Zelllinien erzeugte eine Erregungs- Kontraktions-Kopplung mit cardialen Eigenschaften. Die Komputersumulation der auf diese Weise experimentell erhobenen Daten in einem virtuellen Modell für Herzzellen, zeigte, dass die verminderte Funktion der a 2 d-1 Kanaluntereinheit zu einer Verlängerung des Aktionspotentials führt wie sie bei Herzrhythmusstörungen beobachtbar ist. Die Kombination unserer einzigartigen Muskelzellsysteme mit rekombinanten Expression und siRNA Techniken und Computersimulation stellt eine neuartige und wirkungsvolle Strategie zur Erforschung der Auswirkungen von genetischen Veränderungen in Kalziumkanälen auf die Funktion von Skelett- und Herzmuskel dar. Somit führen die neu entwickelten Zellmodelle und experimentellen Strategien nicht nur zu einem verbesserten Verständnis der Kalziumkanalfunktion im Muskel, sondern sie stellen überdies eine wertvolle Alternative zu Experimenten an Gen- modifizierten Tiermodellen dar.