Untersuchung gerichteter Zellbewegung mit TIRF-Mikroskopie

Die Fähigkeit von Zellen sich zu bewegen ist von grundlegender Bedeutung für das Leben an sich, vor allem im Zusammenhang mit Entwicklungs- und Reparaturprozessen. Ebenso spielt die Zellbewegung eine Rolle bei bestimmten Erkrankungen, wie etwa bei der Abwanderung von malignen Zellen während der Metastasierung von Tumoren. Ermöglicht wird die Zellbewegung durch die dynamische Bildung und Reorganisation von Aktinfilamenten, die das Aktinzytoskelett aufbauen. Gerichtete Bewegung kann allerdings nur mit einer sich vorschiebenden Front und einem sich nachziehenden Zellhinterende stattfinden. Diese Polarisation benötigt die Beteiligung eines dynamischen Netzwerkes aus Mikrotubuli. Im vorhergehenden Projekt konnten wir den Mechanismus, über den Mikrotubuli ihren polarisierenden Effekt höchstwahrscheinlich ausüben, identifizieren. Wir konnten zeigen, dass Mikrotubuli gezielt Zell-Substrat Kontakte aufsuchen; Orte der vorübergehenden Verbindung zwischen dem Aktinzytoskelett und der extrazellulären Matrix über die Membran hinweg. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mikrotubuli den Umbau bzw. Abbau von Zell-Substrat Kontakten fördern. Diese Regulation der Kontakte geschieht in einer räumlich definierten Art und Weise, wodurch die Organisation des Aktinzytoskelettes - und damit die Zellpolarität - beeinflusst wird. Dieses Projekt zielt ab auf die Charakterisierung 1) der Bedeutung der Wechselwirkung zwischen Miktotubuli und Kontakten für die Polarisation verschiedener Zelltypen; 2) des Mechanismus, über den Mikrotubuli zu den Zell- Substrat Kontakten geführt werden; 3) der Proteinkomplexe, die bei der Anlieferung des Signales, das den Kontaktumbau moduliert, involviert sind. Zu diesem Zweck planen wir die Technik der "evanescent wave microscopy" einzusetzen, die, wie wir kürzlich gezeigt haben, ideal ist, um die Mikrotubuli - Kontakt Interaktion genau zu analysieren. Unsere Studien zielen darauf ab, tiefere Einblicke in die fundamentalen Mechanismen zu gewähren, die der gerichteten Zellbewegung zu Grunde liegen.

Die zielgerichtete Bewegung von Zellen spielt eine wesentliche Rolle in der Embryonalentwicklung, bei der Infektionsabwehr durch das Immunsystem und der Wundheilung. Andererseits kann unkontrollierte Zellmigration als Konsequenz eine breite Ausstreuung von Tumorzellen im Organismus durch Metastasenbildung haben. Um diese Migrationsprozesse von Zellen beeinflussen zu können, müssen die grundsätzlichen Signalwege aufgedeckt und verstanden werden, die es Zellen ermöglichen, sich zu einem bestimmten Zeitpunkt gerichtet zu einem Ort zu bewegen. Ziel des vorliegenden Projektes war die Untersuchung, wie Zellen während ihrer Migration geleitet werden. Die gerichtete Bewegung einer Zelle ist ein komplexer Vorgang, der mit dem Vorschub einer Zelle in Richtung ihrer Bewegung (Protrusion) und der Ausbildung von neuen Zellverbindungen mit dem Substrat (Adhäsion) beginnt. Um eine Vorwärtsbewegung der Zelle zu ermöglichen, müssen dabei die posterioren Zellkontaktpunkte vom Substrat gelöst werden. Jede dieser Phasen während der Zellbewegung ist abhängig vom dynamischen Umbau des Aktinzytoskeletts. Zusätzlich erforderlich zum Aktinzytoskelett ist allerdings ein intaktes Netzwerk von Mikrotubuli, im Besonderen für die zielgerichtete Zellbewegung. Ein enges Zusammenspiel von Aktinfilamenten mit Mikrotubuli ist deshalb für eine effiziente Zellmigration notwendig. In einem vorangegangen Projekt konnte gezeigt werden, dass ein derartiges Zusammenwirken bei der gezielten Interaktion von polymerisierenden Mikrotubuli mit Substratkontaktpunkten (Adhäsionspunkten) in Fibroblasten zu beobachten ist. Aufgrund dieser Beobachtung wurde die Hypothese aufgestellt, dass Mikrotubuli die Richtung der Zellbewegung beeinflussen, indem sie den dynamischen Auf- und Abbau der Substratadhäsionspunkte regulieren. Das vorliegende Projekt hatte deshalb zum Ziel zu untersuchen, ob die Interaktion von Mikrotubuli mit den Adhäsionspunkten eine generelle Beobachtung in sich bewegenden Zellen ist und welche Proteine bei diesem Vorgang eine Rolle spielen. Die technische Vorraussetzung für diese Studien war ein Total-internal-fluorescence` (TIRF) Mikroskop, das eine selektive Analyse der ventralen Seite (nahe des Substrates) von sich bewegenden Zellen erlaubt, an der die Interaktion von Mikrotubuli mit Adhäsionspunkten stattfindet. Wir konnten zeigen, dass in sich schnell bewegenden Neutrophil-ähnlichen Zellen ebenfalls die Interaktion von Mikrotubuli mit Adhäsionspunkten zu beobachten ist wie in Fibroblasten und anderen Zelllinien. Diese Beobachtung legt also ein generelles Phänomen während der Steuerung von Zellbewegung nahe. Wie allerdings finden die Mikrotubuli ihr Ziel in die Zelladhäsionspunkte? Basierend auf Studien in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) haben wir die Involvierung von Motorproteinen der MyosinV-Familie untersucht, die als Verbindung zwischen polymerisierenden Mikrotubuli-Enden und Aktinfilamenten dienen könnten. Dazu wurden Zellen untersucht, die exogen defekte Motormoleküle über-exprimierten oder bei denen die Expression von MyosinV durch RNA Interferenz gestört wurde. Hierbei konnte allerdings bisher kein Defekt bei der Interaktion von Mikrotubuli mit den Adhäsionspunkten beobachtet werden. Dennoch konnte bei diesem Versuchsansatz eine geänderte Zellbeweglichkeit während Wundheilung beobachtet werden, die auf eine Rolle von MyosinV für die Ausbildung von Zellpolarität hinweist, welches momentan noch näher untersucht und charakterisiert wird. Um eine systematischere Analyse der Moleküle zu erstellen, die bei der Mikrotubuli-Adhäsionspunkte Interaktion involviert sind, haben wir eine Genom-weite RNAi Analyse basierend auf einer mikroskopischen Auswertung entwickelt. Diese Analyse wurde in Zusammenarbeit mit dem EMBL in Heidelberg angefertigt und verspricht Proteinkandidaten und Signalwege hervorzubringen, die beim dynamischen Umbau von Substratadhäsionen eine wesentliche Rolle spielen.