Mechanismus der Chorismatsynthase

Der Shikimatweg besitzt eine herausragende Bedeutung für die Biosynthese von aromatischen Verbindungen in Bakterien, Pilzen und Pflanzen. Da dieser Stoffwechselweg in höheren Tieren vollständig fehlt, stellen die Enzyme des Shikimatweges interessante Wirkstoffziele für die Entwicklung von Antibiotika, Fungiziden und Herbiziden dar. Beispielhaft sei an dieser Stelle das Breitbandherbizid Glyphosat erwähnt, welches die 5-Enolpyruvylshikimat- 3-phosphat Synthase sehr effektiv hemmt. Das nachfolgende Enzym, die Chorismatsynthase, katalysiert eine anti- 1.4-Eliminierungsreaktion. Dieses Enzym ist abhängig von der Anwesenheit eines reduziertes Kofaktors, dem Flavinmononukleotid (auch als Vitamin B2 bekannt). Kürzlich konnte durch die Aufklärung der räumlichen Struktur des Proteins gezeigt werden, dass das Substrat in enger Nachbarschaft zum Kofaktor gebunden wird und diesem daher eine besondere Rolle bei der Katalyse zugeschrieben werden kann. Die Verfügbarkeit einer hochauflösenden Röntgenstruktur erlaubt es nun den Mechanismus der Enzymkatalyse eingehender zu untersuchen. Dazu werden die Aminosäurereste im Aktivzentrum des Enzyms mittels Mutagenese gezielt ausgetauscht und die mutierten Proteine mit Hilfe kinetischer und spektroskopischer Methoden charakterisiert. Dieser Ansatz wird zu einem detaillierten Verständis der Funktion der Aminosäuren im Aktivzentrum führen und uns ein tieferes Verständnis der Enzymkatalyse ermöglichen. Ein zweiter Schwerpunkt unseres Forschungsvorhabens betrifft die Herkunft des reduzierten Kofaktors. Im Falle der sogenannten "monofunktionalen" Chorismatsynthasen wird angenommen das spezialisierte NADPH-abhängige Oxidoreduktasen das reduzierte FMN bereitstellen und dieses dann an die Chorismatsynthase weitergeben. Dieser Prozess findet voraussichtlich in einem Proteinkomplex statt, den wir aus dem Modellorganismus Bacillus subtilis aufreinigen wollen, mit dem Ziel die beteiligt Oxidoreduktase zu identifizieren. "Bifunktionale" Chorismatsynthasen, die bisher nur in Pilzspezies wie der Bäckerhefe gefunden werden konnten, besitzen dagegen die Fähigkeit NADPH direkt für die Reduktion des FMN-Kofaktors zu verwenden (das Enzym besitzt also "zwei" separate Aktivitäten). Mit Hilfe der dreidimensionalen Struktur der Chorismatsynthase wollen wir untersuchen welche strukturellen Parameter für diese zusätzliche Aktivität der bifunktionalen Chorismatsynthasen verantwortlich sind.

Der Shikimatweg besitzt eine herausragende Bedeutung für die Biosynthese von aromatischen Verbindungen in Bakterien, Pilzen und Pflanzen. Da dieser Stoffwechselweg in höheren Tieren vollständig fehlt, stellen die Enzyme des Shikimatweges interessante Wirkstoffziele für die Entwicklung von Antibiotika, Fungiziden und Herbiziden dar. Beispielhaft sei an dieser Stelle das Breitbandherbizid Glyphosat erwähnt, welches die 5-Enolpyruvylshikimat- 3-phosphat Synthase sehr effektiv hemmt. Das nachfolgende Enzym, die Chorismatsynthase, katalysiert eine anti- 1.4-Eliminierungsreaktion. Dieses Enzym ist abhängig von der Anwesenheit eines reduziertes Kofaktors, dem Flavinmononukleotid (auch als Vitamin B2 bekannt). Kürzlich konnte durch die Aufklärung der räumlichen Struktur des Proteins gezeigt werden, dass das Substrat in enger Nachbarschaft zum Kofaktor gebunden wird und diesem daher eine besondere Rolle bei der Katalyse zugeschrieben werden kann. Die Verfügbarkeit einer hochauflösenden Röntgenstruktur erlaubt es nun den Mechanismus der Enzymkatalyse eingehender zu untersuchen. Dazu werden die Aminosäurereste im Aktivzentrum des Enzyms mittels Mutagenese gezielt ausgetauscht und die mutierten Proteine mit Hilfe kinetischer und spektroskopischer Methoden charakterisiert. Dieser Ansatz wird zu einem detaillierten Verständis der Funktion der Aminosäuren im Aktivzentrum führen und uns ein tieferes Verständnis der Enzymkatalyse ermöglichen. Ein zweiter Schwerpunkt unseres Forschungsvorhabens betrifft die Herkunft des reduzierten Kofaktors. Im Falle der sogenannten "monofunktionalen" Chorismatsynthasen wird angenommen das spezialisierte NADPH-abhängige Oxidoreduktasen das reduzierte FMN bereitstellen und dieses dann an die Chorismatsynthase weitergeben. Dieser Prozess findet voraussichtlich in einem Proteinkomplex statt, den wir aus dem Modellorganismus Bacillus subtilis aufreinigen wollen, mit dem Ziel die beteiligt Oxidoreduktase zu identifizieren. "Bifunktionale" Chorismatsynthasen, die bisher nur in Pilzspezies wie der Bäckerhefe gefunden werden konnten, besitzen dagegen die Fähigkeit NADPH direkt für die Reduktion des FMN-Kofaktors zu verwenden (das Enzym besitzt also "zwei" separate Aktivitäten). Mit Hilfe der dreidimensionalen Struktur der Chorismatsynthase wollen wir untersuchen welche strukturellen Parameter für diese zusätzliche Aktivität der bifunktionalen Chorismatsynthasen verantwortlich sind.