MAGUK Proteine und Zellkontakte

In den letzten Jahren haben neue Erkenntnisse aus der molekularbiologischen und medizinischen Forschung gezeigt, dass Proteine der engen Zell-Zellverbindungen (tight junctions, TJs) vermutlich eine mehrfache Rolle spielen. So bilden sie nicht nur die strukturelle Basis dieser Verbindungen, sondern sind auch an der Signalübertragung vom Zellinneren zur Plasmamembran und vice versa beteiligt. Zonula occludens proteine (ZOPs) gehören zur Familie der MAGUKs (membrane associated guanylate kinase-like homologues) und sind vornehmlich an TJs lokalisiert. Derzeit sind drei ZOPs beschrieben: ZO-1, ZO-2 und ZO-3. ZOPs weisen mehrere wichtige Proteindomänen auf, wovon einige für die Struktur der TJs notwendig sind und andere das Potential für Protein-Protein Interaktionen und Signalübertragung besitzen. ZOPs weisen eine hohe Homologie zum Drosophila disc large (dlg) Tumor Suppressor Protein auf. Es liegen auch vermehrt Daten vor, wonach ZOPs in Tumorentstehung bzw. -wachstum eine Rolle spielen. Wir haben beobachtet, dass ZO-2 in Epithelzellen und Endothelzellen unter bestimmten Bedingungen im Kern lokalisiert ist. Obwohl noch eine ausführliche experimentelle Untersuchung fehlt, besteht die Annahme, daß diese Kernwanderung von ZO-2 ein wichtiger Schritt in jener intrazellulären Signal-Kaskade ist, die letztlich zu erhöhter Mobilität und reduzierter Haftung von Endothelzellen und Epithelzellen führt. Weitere Experimente unserer Arbeitsgruppe haben ergeben, daß ZO-2 direkt mit einem DNA/RNA-Bindungsprotein (SAF-B), das seinerseits als Co-Repressor des Östrogen-Rezeptors alpha fungiert, interagiert. Im vorliegenden Projekt wollen wir uns weiter auf die Kernlokalisierung von ZO-2 konzentrieren. Mittels DNA- und Proteinanalysen werden wir die biologische Konsequenz dieser aberranten Translokation studieren. Darüberhinaus werden wir uns auf die Interaktion von ZO-2 mit SAF-B konzentrieren und eine mögliche Auswirkung der ZO-2/SAF-B Bindung auf die Aktivität des Östrogenrezeptors untersuchen. Das technische Spektrum des Projekts umfasst Zellkultur und Transfektions-Experimente, confocale Mikroskopie, spezifische DNA-Mutagenese, "Gene Profiling", 2D-Gel-Elektrophorese, Massenspektrometrie (MALDI), Co- Immunpräzipitation und Two-Hybrid Assays.

Dichte Zell-Zellverbindungen bestehen aus transmembranen Komponenten und den daran gebundenen cytoplasmatischen Proteinen. Letztere werden als junctionale periphere Proteine bezeichnet. Die extrazellulären Anteile der transmembranen Proteine interagieren mit den korrespondierenden Proteinen einer benachbarten Zelle, wodurch ein interzellulärer Verschluss ("seal") zustande kommt. Viele Proteine wurden bisher an der zytoplasmatischen Seite solcher Zellerbindungen beschrieben. Allerdings ist die Funktion mancher solcher Proteine noch weitgehend ungeklärt. Zonula occludens Proteine (ZOPs) sind periphere Gerüstproteine, die aufgrund ihrer Struktur zur Klasse der MAGUK (Membran-assoziierte Guanylat Kinase)-ähnlichen Proteine gezählt werden. ZO Proteine besitzen mehrere Protein-Domänen und umfassen derzeit 3 Typen: ZO-1, -2, und -3. Diese sind sowohl in den strukturellen Aufbau der dichten Zell-Zellverbindungen als auch in intrazelluläre Signalwege involviert. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass ZO-2 sich in den Kernen von Endothel- und Epithelzellen als Antwort auf Stressbedingungen (Hitzeschock, chemischer Stress) anreichert. In den letzten Jahren haben wir uns besonders der Aufklärung der Kern-Lokalisierung und Kern-assoziierten Funktion von ZO-2 gewidmet. Für diese Studien wurden stabil transfizierte Zellinien, welche erhöhtes Kern-ZO-2 exprimierten, hergestellt. Anschließend wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt um neue ZO-2 Protein-Protein Interaktionen und mögliche Folge- Effekte (z.B. Veränderungen der Gen- und Proteinexpression, oder veränderte Proliferations- und Migrations- Raten) der erhöhten ZO-2 Kernpräsenz zu detektieren. Die Resultate aus diesen Studien zeigten, dass die nukleäre Akkumulierung von ZO-2 einen Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression ausübt. Eine veränderte Expressionsrate wurde vor allem für solche Proteine, welche mit Zell-Metabolismus, Barriere-Funktion, Migration und Stress-Antwort in Zusammenhang stehen, gefunden. Weiters konnten neue Interaktionen von ZO-2 mit einem Transkriptionsfaktor, sowie mit einem Nucleolus-assoziierten Phosphoprotein beschrieben werden. Die hohe Expression von Kern-ZO-2 in Epithel und Endothelzellen führte auch zur verminderten Expression einer bestimmten Matrix-Proteinase, welche ebenfalls bei Sauerstoff-Unterversorgung der Zellen (Hypoxie) eine schädigende Rolle spielt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass ZO Proteine eine Doppelfunktion ausüben. Neben ihrer Struktur-Aufgabe an der Plasmamembran agieren sie auch als Komponenten von Signalwegen, die letztendlich in Veränderungen der Genexpression münden.