ZYMV-Infektion:die Rolle von Glutathion und dessen Vorstufen

Der Anbau des steirischen Ölkürbis (Cucurbita pepo L. subsp. pepo var. styriaca GREB.) hat in der Steiermark eine lange Tradition, und besitzt aufgrund der Produktion des "geographisch geschützten" steirischen Kernöls eine große Bedeutung in der regionalen Landwirtschaft. Seit 1996 kommt es zu massiven Ernteverlusten die auf das Auftreten des Zucchinigelbmosaikvirus (ZGMV) zurückzuführen sind. ZGMV löst in den Pflanzenzellen verschiedenste Ver- änderungen aus, noch bevor Symptome von außen erkennbar sind. Mit dem Transmissions-Elektronenmikroskop ist es möglich substrukturelle Veränderungen zu erkennen noch bevor erste Symptome auftreten. Dieses Wissen dient als wichtige Grundlage zur Entwicklung von Bekämpfungstrategien und Pflanzenschutzmittel. Erhöhte Konzentrationen von Glutathion (=Antioxidans) schützen Pflanzen vor Sauerstoffradikalen, die in Abhängigkeit von verschiedensten umweltbedingten Stresssituationen, wie z.B. Pathogenbefall in der Pflanze verstärkt gebildet werden. So können während verschiedenster Pilz und Bakterieninfektionen erhöhte Glutathionkonzentrationen festgestellt werden. Über Veränderungen im Glutathiongehalt während Virusinfektionen in toleranten (inkompatibel) und nicht resistenten (kompatibel) Pflanzen ist nur wenig bekannt und es gibt keine Informationen über Konzentrationsänderungen von Glutathionvorstufen, während der Virusinfektionen. Die Ziele dieses Projektantrages sind es zu untersuchen, ob und in welchen pflanzlichen Organen und Zellorganellen, während kompatibler und inkompatibler ZGMV-Infektionen, Veränderungen im Glutathiongehalt und im Gehalt der Glutathionvorstufen Glutamat, Glycin und Cystein in Kürbispflanzen beobachtet werden können. Glutathion und dessen Vorstufen werden dabei mit spezifischen Antikörpern gegen Glutathion, Glutamate, Glycin und Cystein markiert und mit sekundären Gold-konjugierten Antikörpern im Transmissionselektronenmikroskop sichtbar gemacht. Die Ergebnisse werden Aufschluss über eventuelle Unterschiede in der Produktion und im Abbau von Glutathion zwischen den toleranten und den nicht resistenten Pflanzen geben. Gemeinsam mit den Ergebnissen des vorangegangen Projektes, über Veränderungen im Glutathionhaushalt während der kompatiblen ZGMV-Infektion im steirischen Ölkürbis, sollten die Ergebnisse dieses Projektes die Mechanismen hinter der schützenden Rolle von Glutathion während kompatibler und inkompatibler Virusinfektion offenbaren. Dieses Wissen liefert einen wertvollen Beitrag in der Bekämpfung der Viruserkrankungen am steirischen Ölkürbis und könnte langfristig vor massiven Erntenverlusten schützen. In Kooperation mit Prof. Dr. Rüdiger Hell, Deutschland und Prof. Dr. Felix Mauch, Schweiz, planen wir die oben genannten Methoden auch auf transgene Modellpflanzen (Arabidopsis und Tabak) auszuweiten, um die Ergebnisse mit anderen internationalen Studien, die mit diesen Pflanzen durchgeführt wurden, vergleichen zu können. In Tabakpflanzen wird der Einfluss von Cysteinüberexpression und in Arabidopsis werden die Auswirkungen der Überexpression von -Glutamylcysteinsynthetase auf den Glutathiongehalt und auf den Gehalt der Vorstufen untersucht. Es soll geklärt werden in welche Zellkompartimente der Überschuss an Cystein im Tabak bzw. Glutathion in beiden Pflanzen transportiert wird. Diese Kooperationen werden unser Wissen über den Glutathionhaushalt und die Redoxregulation in Pflanzen vertiefen und neue wissenschaftliche Fragen für weitere Projekte schaffen.

Im Verlaufe dieses Projektes wurden neue Methoden entwickelt, die die Visualisierung und Quantifizierung von Glutathion und dessen Vorstufen (Cystein, Glutamat, Glycin) in allen Zellkompartimenten simultan in einem Experiment mit sehr hoher Auflösung erlauben. Glutathion ist ein Antioxidans; es ist in die Entgiftung freier Sauerstoffradikale, welche im Verlaufe von Stresssituationen entstehen und zur Zerstörung von biologischen Membranen, Proteinen, RNA und DNA führen, involviert, was Mutationen, Krebs und Zelltod zur Folge hat. Veränderungen im Glutathiongehalt gelten deshalb als Stressmarker in vielen Untersuchungen der Pflanzenwissenschaften. Im Glutathionmetabolismus sind hoch spezialisierte Stoffwechselwege, die auf Einzelkompartimente bezogen sind, involviert und mögliche Limitationen in der Stressabwehr durch Glutathion können nur durch die Detektion von Glutathionkonzentrationen auf subzellulärem Weg beobachtet werden. Im Verlaufe dieses Projektes wurde ein Immunogold-Cytohistochemischer Ansatz ausgearbeitet und für unterschiedliche Pflanzen adaptiert um Glutathion und dessen Vorstufen subzellulär mit Hilfe von computerunterstützter Elektronenmikroskopie (TEM) zu detektieren und zu quantifizieren. Diese Studien zeigten, dass die subzelluläre Glutathionverteilung in unterschiedlichen Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Cucurbita pepo, Nicotiana tabacum, Beta vulgaris) sehr ähnlich ist. Überraschenderweise wiesen die Plastiden, die als Hauptakkumulator von Glutathion galten, die niedrigsten Gehalte auf, während die höchsten Werte in den Mitochondrien auftraten. Andere Zellstrukturen blieben in der Mitte, in Vakuolen und im Apoplasten wurde kein Glutathion beobachtet. Die Exaktheit der Methodik unterstützten weitere Untersuchungen, wie 1. das Absättigen der Anti-Glutathion-Antisera mit Glutathion (Reduktion der Goldpartikel auf Hintergrundwerte). 2. Die Glutathion-Labeling Intensität wurde in Blättern von mit Glutathion unterversorgten Arabidopsismutanten um ca. 90% reduziert und in Pflanzen, die eine erhöhte Glutathionakkumulation haben, signifikant erhöht. Diese Experimente bewiesen hohe und stabile Glutathionwerte in Mitochondrien und die wichtige Rolle, die Glutathion in Pflanzen spielt. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Glutathionsynthese während eines Pathogenbefalls von der Verfügbarkeit der Glutathionvorstufen intensiv limitiert wird. Die tolerante Cucurbita pepo cv. Quine (welche eine stärkere Glutathionzunahme als die sensible Art zeigte) zeigte erhöhte Werte der Glutathionvorstufen (besonders von Cystein) während der Virusinfektion, während die sensible Art generell erniedrigte Werte aufwies. Eine künstliche Cysteinerhöhung führte zu einer starken Zunahme im Glutathiongehalt und zu einer Symptomunterdrückung mit einer erniedrigten Anzahl von Viruspartikeln in Blättern und Wurzeln während der kompatiblen Virusinfektion in Cucurbita und wies Cystein als limitierenden Faktor in der Glutathionsynthese aus. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Entwicklung und Anwendung dieser neuen Methoden aufzeigen, dass Glutathionvorstufen, besonders Cystein die Aufgaben des Glutathionmetabolismus während eines Pathogenbefalls stark limitieren. Die Modifikation (Erhöhung) der Cysteingehalte in Pflanzen während eines Pathogenbefalls resultierte in einer starken Erhöhung der Glutathionlevels und damit in einer erhöhten Stresstoleranz während der Virusinfektion im Steirischen Ölkürbis. Damit können diese Studien und Methoden für die Entwicklung neuer Abwehrstrategien im Ackerbau der Zukunft, wie auch für den Schutz vor möglichen Ernteverlusten durch Umweltstresse, genutzt werden.