En-und Exzystierungs Proteine bei Acanthamoeba castellanii

Zelldifferenzierungsprozesse wie die Enzystierung, stellen ein häufiges Phänomen bei eukaryontischen Einzellern, darunter auch zahlreichen Erregern von Infektionskrankheiten des Menschen, dar. Die Zyste ermöglicht diesen Mikroorganismen die Überdauerung widriger Umweltbedingungen und hält somit den Infektionszyklus aufrecht. Bei Vertretern des weitverbreiteten Genus Acanthamoeba, zu welchem die Erreger der Akanthamöben-Keratitis und der Granulomatösen Amöbenenzephalitis gehören, werden die Zysten als Reaktion auf widrige Umweltbedingungen (einschließlich Biozid-Behandlung) gebildet. Zysten, welche eine Behandlung überleben, führen zu einem schwereren Verlauf der Krankheit oder zu einem Wiederaufflammen der Infektion - und auch die Vektorenrolle der Akanthamöben ist auf deren widerstandsfähigen Zysten zurückzuführen. Obwohl Acanthamoeba castellanii aufgrund der hohen Wachstumsgeschwindigkeit und der leichten Kultivierbarkeit bereits seit einigen Jahrzehnten als Modellorganismus in zellbiologischen Studien dient, sind die molekularen Mechanismen der Enzystierung von Akanthamöben bisher nicht geklärt. Die Fähigkeit zur Zystenbildung ist aber nicht nur bei Akanthamöben für ihre Rolle als Krankheitsserreger und als Überträger humanpathogener Bakterien, sondern auch bei zahlreichen anderen pathogenen Protozoen von grundlegender medizinischer und ökologischer Bedeutung. Eine Aufklärung dieses komplexen Prozesses ist deshalb von weit reichendem Interesse. Das Ziel unserer Studie ist, die Enzystierung von A. castellanii mit modernen molekularbiologischen Methoden zu untersuchen und ein Modell für die Zelldifferenzierung bei Protozoen zu etablieren. Eine Proteom-Analyse mittels zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE) und die nachfolgende genetische Analyse sollen die Schlüsselmoleküle der En- und Exzystierung bei Akanthamöben identifizieren. Zunächst sollen die während der Zelldifferenzierung bevorzugt exprimierten Proteine aus 2D-Gelen isoliert, identifiziert und anschließend, auf genetischer Ebene, auf regulatorische Sequenzen hin untersucht werden. Mit Hilfe dieser Regulator-Sequenzen kann dann das Genom von A. castellanii auf jene Gene hin durchsucht werden, welche in Differenzierungsprozesse involviert sind. Hierbei sollen auch in niedriger Kopienzahl vorliegende Faktoren, wie transkriptionelle Aktivatoren oder Repressoren, miteinbezogen werden. Durch diesen revers-genetischen Ansatz können zahlreiche Strukturgene und regulative Gene identifiziert und somit die Zelldifferenzierung von A. castellanii aufgeklärt werden. Das Acanthamoeba-Modell - von der jungen, induzierten bis zur reifen Zyste - einschließlich der zeitlichen und hierarchischen Anordnung der exprimierten Gene, stellt die Grundlage für vergleichende Studien unter Miteinbeziehung anderer zystenbildender pathogener Protozoen, wie Entamoeba histolytica und Giardia lamblia, dar. Darüber hinaus soll basierend auf der Kenntnis der am Differenzierungsprozess beteiligten Gene der Einfluss bakterieller Endozytobionten auf die Enzystierung von A. castellanii durch RNA-Profiling evaluiert werden.

Akanthamöben sind primär freilebende Amöben und erfüllen weltweit in vielen Habitaten eine wichtige ökologische Funktion als Prädatoren von Bakterien. Allerdings sind Akanthamöben nicht nur von ökologischem Interesse, sie können auch als Vektoren für humanpathogene Bakterien, z.B Legionella pneumophila, fungieren, oder selbst Krankheiten im Menschen hervorrufen, nämlich Keratitits und Enzephalitis. Der Lebenszyklus von Acanthamoeba umfasst zwei Stadien: das Trophozoitenstadium, in dem die Zellen wachsen und sich teilen, und das Zystenstadium, welches eine Dauerform darstellt und gegenüber Umweltstress und Therapeutika unempfindlich ist. Die Enzystierung ist vom medizinischen Standpunkt aus betrachtet problematisch, da die Zysten eine anfänglich erfolgreiche Therapie überstehen und anschließend Rezidive auslösen können. Das Hauptziel dieses Projekts war es, die am Enzystierungsprozess beteiligten molekularen Prozesse zu untersuchen, und zwar insbesondere auf Proteinebene. Wir konnten zeigen, dass zu Beginn der Enzystierung die Proteinexpression keine Rolle spielt, und dass nahezu alle Veränderungen in der Proteinzusammensetzung auf einen autolytischen Proteinabbau zurückzuführen sind, katalysiert durch Cysteinproteasen. In enzystierenden Amöben ist die Fähigkeit zur Protein- Synthese zunächst eingeschränkt, da die Expressionslevel der hierfür notwendigen Faktoren erniedrigt sind. Im weiteren Verlauf der Enzystierung, werden sowohl Proteine des Trophozoitenstadiums wieder synthetisiert als auch enzystierungsspezifische Proteine. Interessanterweise war die Gesamtproteaseaktivität und die Enzystierungsfähigkeit bei Stämmen in Dauerkultur stark verringert, was zusätzlich auf eine starke Abhängigkeit des Enzystierungsprozesses von Protease-Aktivitäten hinweist. Diese Verringerung ist nicht auf Genmutationen zurückzuführen, sondern auf epigentische Genregulation, da beide Parameter durch Kultivierung der Amöben auf menschlichen Zellen oder durch Zugabe von Chemikalien, welche der epigentischen Regulation der Genexpression entgegenwirken, weitgehend wiederhergestellt werden konnten. Schließlich entdeckten wir, dass das intrazelluläre Bakterium Parachlamydia acanthamoebae den Enzystierungsprozess bei Acanthamoeba zu einem sehr frühen Zeitpunkt unterbricht und die oben beschrieben autolytischen Prozesse der frühen Enzystierung unterbindet.