Aminoarabinose LPS-epitope

Eine Vielzahl von Gram-negativen Bakterien verfügt über effiziente Abwehrmechanismen gegenüber dem Immunsystem der jeweiligen Wirtsorganismen. Die äußere Membran der bakteriellen Zellwand ist gekennzeichnet durch die Anwesenheit zahlreicher negativ geladener Substituenten in Form von Säure- bzw. Phosphathältigen Kohlenhydratstrukturen. Die Barrierewirkung der Zellmembran wird jedoch insbesondere durch entgegengesetzt (positiv) geladene Eiweißverbindungen (Peptide) des angeborenen Immunsystems überwunden, wogegen sich viele Bakterien wiederum durch Einbau positiv geladener Aminozucker schützen und somit resistent werden. Während die diesem Resistenzmechanismus zugrunde liegende genetische und biosynthetische Basis inzwischen intensiv bearbeitet wird, weiß man noch sehr wenig über die molekularen Details und antigenen Wirkungen dieser zusätzlichen Zuckermodifikationen. Darüber hinaus sind diese Modifikationen auch als potentielle Schaltstellen für den weiteren Aufbau der Zuckerketten und die Anknüpfung weiterer Fettsäuren an die Membrankomponenten beteiligt. Auch die Temperaturanpassung pathogener Bakterien beim Wechsel von Säugetierwirten auf Insekten, wie sie bei den Erregern der Pest stattfindet, korreliert mit dem erhöhten Einbau dieser Zuckerstrukturen. Von besonderer Bedeutung sind diese Membranmodifikationen auch in den pflanzenpathogenen Burkholderien, die landwirtschaftlich zur Reduktion von Schimmelpilzbefall oder zum Abbau von Schadstoffen in Böden genutzt werden, aber in den letzten Jahren zunehmend Bedeutung als Humanpathogene erlangt haben. Die Besiedlung der Lunge mit Burkholderia cepacia führt zum drastischen Verfall der Lungenfunktion und in Form des "Cepacia- Syndroms" zu einem letalen Verlauf der Infektion. Die Multiresistenz vieler klinischer Isolate gegen die meisten gängigen Antibiotika ist eine weitere Besonderheit von Burkholderien, die selbst im Inneren von Abwehrzellen (Makrophagen) lebensfähig bleiben. Im Rahmen des Projekts sollen durch chemische Synthese komplexe Strukturelemente dieser Membranmodifikationen hergestellt und durch Anbindung an Rinderserumalbumin in immunogene Verbindungen überführt werden. Die geplanten Zuckerstrukturen enthalten neben dem Aminozucker zusätzlich sowohl Säure- als auch Phosphatgruppen, um die wechselseitige Auswirkung auf die räumliche und chemische Interaktion dieser Gruppen zu untersuchen. In gut etablierten internationalen Kooperationen werden die chemisch hergestellten Immunreagentien zur Charakterisierung bestehender Antikörper aber auch zur Erzeugung neuer Antikörperspezifitäten eingesetzt. Die neuen Antikörper sollen in der Folge auch als Werkzeuge zur Untersuchung einzelner Biosyntheseschritte der Membranabschnitte und weiterer Modifikationen dienen. Dabei ist insbesondere eine stabile Zuckersäure interessant, für deren Einbau eine neue enzymatische Aktivität postuliert wird. Darüber hinaus wird auch die Wirkung des Einbaus der Aminozucker auf die Erkennung bzw. Maskierung der weiter außen liegenden Zuckersäuren untersucht werden, wobei hier die Röntgenstrukturanalyse der Cokristalle der Kohlenhydrat-Liganden mit den Antikörperfragmenten zum Einsatz kommen soll.

Viele Gram-negative pathogene Bakterien verfügen über effiziente Abwehrmechanismen gegenüber dem Immunsystem der jeweiligen Wirtsorganismen. Dabei spielen Säure- bzw. Phosphathaltige Kohlenhydratstrukturen in der äußeren Membran der bakteriellen Zellwand eine wichtige Rolle. Unter anderem wird die Barrierewirkung der bakteriellen Zellmembran gegenüber positiv geladenen Eiweißverbindungen (Peptide) der Immunabwehr durch Einbau gleichermaßen positiv geladener Aminozucker (Aminoarabinose) verstärkt. Im Projekt wurden zunächst Synthesemethoden zur Herstellung der Aminoarabinose im Multigramm-Maßstab entwickelt. In weiterer Folge wurde die Aminoarabinose mit den Zuckersäuren Desoxyoctulosonsäure (Kdo) und Octulosonsäure (Ko) verknüpft. Die hergestellten Di- und Trisaccharideinheiten entsprechen Strukturausschnitten der Zellwand von Burkholderien und Proteus. Ein wesentlicher Fortschritt konnte sodann in der Kopplung dieser Einheiten an Proteine erzielt werden. Dazu wurden die Kohlenhydratliganden mit reaktiven Endgruppen versehen, die selektiv und in hoher Ausbeute an Rinderserumalbumin gebunden wurden. Die so erhaltenen Konjugate wurden in der Folge zur Immunisierung von Mäusen und Kaninchen eingesetzt und die daraus resultierenden Seren auf Reaktivität mit verschiedenen Bakterienlipopolysacchariden getestet. Dabei zeigte sich eine hohe Immunogenität der hergestellten Glykokonjugate und eine spezifische Bindung der polyklonalen Seren an solche Aminoarabinose-Strukturen die auch in der bakteriellen Zellwand gut zugänglich sind. Diese Antikörperspezifitäten sind somit sehr gut für den Nachweis von Proteus bzw. Burkholderia-Infektionen geeignet. Konjugate, die sich zur weiteren Differenzierung von Proteus und Burkholderia eignen, werden derzeit noch getestet. In einem internationalen Folgeprojekt werden diese Ergebnisse im Zusammenhang mit Lungenerkrankungen wie der Cystischen Fibrose zum Einsatz kommen. Die direkt in die Lipidmembran eingebaute Phosphat-hältige Aminoarabinose wurde hingegen von den Antikörpern nicht erkannt. Zur weiteren Abklärung der Immunreaktivität dieser Abschnitte wurden daher auch Aminoarabinose- phosphate an Rinderserumalbumin gekoppelt. Immunisierungen mit diesen Konjugaten werden noch erfolgen. Die im Projekt hergestellten Zuckersäuren wurden weiters mit Kdo-spezifischen Antikörperfragmenten cokristallisiert und die Röntgenstruktur der Liganden in der Antigenbindungsregion ermittelt sowie die Bindungsaffinitäten mit Oberflächenplasmon-resonanzspektroskopie gemessen. Dabei zeigte sich daß zusätzliche Möglichkeiten der Wechselwirkung durch Wasserstoffbrückenbindungen in der Bindungsregion dieser Antikörper keine Erhöhung der Affinität bewirken. Die Modifikation der Kohlenhydratliganden durch hydrophobe Strukturelemente führte jedoch zu einer erheblichen Zunahme der Spezifität und der Bindungsaffinität der Antikörper. Diese Ergebnisse sind somit generell für Kohlenhydrat-Antikörper Wechselwirkungen von Bedeutung.