dHPLC zur Untersuchung anaerober Populationen

Sowohl die absoluten, wie auch die relativen Mengen an biologisch behandelbaren Abfällen haben in den letzten Jahren konstant zugenommen. Da die Deponieflächen begrenzt sind, die aerobe Kompostierung mit einigen Problemen (Geruchsbelästigung, Schädlinge) verbunden ist und bei der Vergärung zusätzlich energetisch nutzbares Biogas entsteht, hat sich die anaerobe Vergärung als zukunftsweisende Alternative zur biologischen Abfallbehandlung herausgestellt. Nichts desto trotz erfolgt die Steuerung entsprechender Anlagen häufig empirisch, da viele der im Fermenter stattfindenden Vorgänge nach wie vor erst ansatzweise verstanden sind. Das liegt unter anderem daran, dass sich große Teile der beteiligten Mikroorganismen einer Kultivierung und damit einer physiologischen Untersuchung entziehen. Selbst für die kultivierbaren Organismen ist ein spezielles Equipment und Know-how erforderlich, was deren Untersuchung erschwert. Es gab und gibt daher umfassende Anstrengungen, mit kultivierungsunabhängigen Methoden die mikrobiellen Populationen solcher Habitate zu charakterisieren. Im vorliegenden Antrag wird eine neue Methode vorgestellt, die ursprünglich im medizinischen Bereich entwickelt worden ist und schnell und einfach durchzuführen sein sollte: die denaturing High Performance Liquid Chromatography (dHPLC). Bei dieser Methode wird die zu untersuchende Nukleinsäure (analog zum Gel einer DGGE) über eine HPLC-Säule aufgetrennt, was nicht nur das Verfahren vereinfacht und beschleunigt, sehr gut reproduzierbar und präzise ist, sondern auch eine Quantifizierung und Sammlung der aufgetrennten Fraktionen und damit eine schnelle weitere Analyse (z.B. Sequenzieren) erlaubt. Trotz dieser Vorteile ist die in anderen Bereichen bereits gut etablierte Methode noch kaum für ökologisch orientierte Fragestellungen und noch nie in Zusammenhang mit so komplexen Matrices wie Fermenterschlamm angewandt worden. Im gegenständlichen Antrag planen wir nicht nur die Etablierung und Adaptierung der dHPLC-Methode, sondern es sollen die dabei gewonnenen Daten auch in Beziehung zu klassisch mikrobiologischen und physiologischen Parametern des Fermenterschlamms und der darin enthaltenen Mikroflora gesetzt werden. Dadurch kann verhindert werden, dass große Datenmengen erarbeitet werden, ohne dass dadurch ein nennenswerter Wissenszuwachs erfolgt. Es werden daher sowohl chemische (Gehalte an Fett, VFA, Cges , Nges etc.) als auch mikrobielle (Kultivierung syntropher Mischkulturen, Profile von C-Quellen-Verwertung, Gesamtkeimzahlen, DGGE-Daten etc.) Daten von den Schlammproben erhoben. Zusätzlich stehen uns durch eine bereits bestehende enge Kooperation mit dem Bioheizkraftwerk Roppen uneingeschränkt alle Prozessparameter (Poduktion und Zusammensetzung des Gärgases, Stoffflüsse, pH, T etc.) eines thermophilen 750.000 Liter-Fermenters zur Verfügung. Durch den Einsatz der innovativen dHPLC-Technik, die Kombination mit chemischen und mikrobiellen Daten und die Verbindung zu den Prozessparametern des Fermenters sind wir überzeugt, ein wenig Licht in die Black-Box der anaeroben Bioabfallvergärung bringen zu können.

Im Projekt "dHPLC zur Untersuchung anaerober Populationen" konnte ein mittels eines gewöhnlichen, in vielen (mikro)biologischen Labors verfügbaren Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Systems eine Methode für die denaturierende HPLC (dHPLC) zur molekularbiologischen Beschreiben einer mikrobiellen Population entwickelt werden. Das biokompatible System umfasst Leitung und Filter aus PEEK, einen UV-Detektor für 254 oder 260 nm und einen Säulenofen mit einer Empfindlichkeit von 0,1C in einem Temperaturbereich von 50 bis 80C. Verschiedene Säulen wurden getestet, als geeignet erwiesen sich jedoch nur zwei (DNA-Sep, Transgenomic und Helix DVB, Varian). Mittels des beschriebenen Systems konnte nach langwierigen PCR Optimierungsversuchen und -ansätzen ein System zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von DNA-Fragmenten gleicher Länge, aber unterschiedlicher Basensequenz und -zusammensetzung gefunden und erfolgreich mit Proben aus drei verschiedenen Habitaten (Boden, Kompost, Fermenterschlamm) getestet werden. Die Methode wurde des Weiteren für die Untersuchung einer anaeroben Population, gemeinsam mit der Erhebung verschiedener, physiko-chemischer sowie mikro- und molekularbiologischer Parameter, eingesetzt. Obwohl sich das dHPLC System für bestimmte Applikationen sehr gut anwenden lässt, bleiben Fragen der Probenauf- und vorbereitung vor allem aber die PCR Optimierung für verschiedene Primerpaare noch zu lösen.