Struktur und Eigenschaften neuronaler Nikotinrezeptoren

Der Neurotransmitter Acetylcholin vermittelt seine Wirkung über 2 grundsätzlich unterschiedliche Mechanismen: Muskarin-Rezeptoren, sowie Nikotin-Rezeptoren, benannt nach den Inhaltstoffen des Fliegenpilzes (Muskarin) sowie der Tabakpflanze (Nikotin). Nikotinische Rezeptoren finden sich in der neuromuskulären Synapse, im peripheren (insbesondere vegetativen) Nervensystem, sowie im Zentralnervensystem. Nikotin-Rezeptoren sind aus jeweils 5 Bausteinen (so genannten Untereinheiten) aufgebaut, wobei zwischen muskulären und neuronalen Rezeptoren unterschieden wird. Die Bindung von Nikotin (oder anderen geeigneten Liganden) aktiviert den Rezeptor, der auch als Ionenkanal fungiert, und vermittelt dadurch den Einstrom von Natrium und Kalzium sowie den Ausstrom von Kalium. Diese Ionenflüsse führen letztendlich zur Kontraktion der Muskulatur (bei Aktivierung von muskulären Rezeptoren), sowie zur Signalübertragung zwischen 2 verschalteten Nervenzellen (bei Aktivierung von neuronalen Rezeptoren). Gegenstand des vorliegenden Projekts sind die neuronalen Rezeptoren des Ganglion Cervicale Superius (GCS), einer für derartige Studien viel verwendeten Struktur. Das Ganglion ist ein Teil des sympathischen Nervensystems und versorgt mit seinen Nerven u.a. die Blutgefäße und Drüsen im Kopf- und Halsbereich. Die im Ganglion gefundenen Untereinheiten (Bausteine) sind a3, a4, a5, a7, ß2, und ß4. Während die Funktion der a7-Untereinheit (bei der sich 5 Moleküle zu so genannten homo-pentameren Rezeptoren zusammenfinden) weitgehend unklar ist, sind hetero-pentamere Rezeptoren bekanntermaßen essentiell für die Funktion des vegetativen Nervensystems im allgemeinen und des GCS im besonderen. Mutationen in diesen Untereinheiten (i.B. a3 sowie ß4) dürften z.B. beim Menschen die Ursache für angeborene Störungen von Darm- und Blasenmotilität sein (megacystis- microcolon-intestinal-hypoperistalsis syndrome, MMIHS). Unsere geplanten Experimente verfolgen eine doppelte Zielrichtung: 1. Die Analyse der Zusammensetzung der Rezeptoren im GCS mit Hilfe von Antikörpern, die spezifisch gegen die hier vorkommenden Untereinheiten gerichtet sind. Wir werden diese Antikörper durch die Immunisierung von Kaninchen und Hühnern und anschließende Extraktion aus Seren sowie Eiern gewinnen. Kenntnisse des Aufbaus der Rezeptoren sind essentielle Voraussetzung zum Verständnis von deren Funktion. 2. Die Analyse funktioneller Eigenschaften von Rezeptoren, die im GCS von Doppel-Knockout Tieren zu finden sind. Wir verfügen derzeit über ein Modell, bei dem Mäusen sowohl die a5 wie auch die ß2 Untereinheit fehlt und erwarten, dass im GCS dieser Tiere (neben a7 homo- pentameren) lediglich a3ß4 hetero-pentamere Rezeptoren vorkommen. Solche Rezeptoren konnten bisher lediglich in so genannten heterologen Expressionssystemen (z.B. Zellinien, die andernfalls keine Nikotinrezeptoren aufweisen), nicht aber in ihrer natürlichen Umgebung (wie dem GCS oder einer anderen Struktur des Nervensystems) untersucht werden. Wir werden im Rahmen des Projektes die Rezeptoren eines zweiten (a5/ß4) KO Modells untersuchen, in dem im GCS lediglich a3ß2 Rezeptoren vorkommen. Dieses Modell ist deshalb von besonderem Interesse, weil sich hier unter Zellkultur-Bedingungen unter dem Einfluss von Nikotin (oder ähnlicher Substanzen wie z.B. ACh) wesentlich mehr Rezeptoren an der Zelloberfläche befinden sollten. Auch diese Beobachtung wurde bisher lediglich an Rezeptoren, die entweder heterolog exprimiert wurden oder in Tumorzellen vorkommen, gemacht. Eine Bestätigung der Befunde in Nervenzellen ist von erheblicher Bedeutung für das Verständnis der Funktion nativer Nikotinrezeptoren im gesamten Nervensystem.

Nikotinische Rezeptoren verdienen Interesse nicht nur im gesunden sondern auch im kranken Organismus. Ihre Bedeutung im Rahmen von Nikotin-Abhängigkeit ist offensichtlich, aber nikotinische Rezeptoren dürften auch bei so unterschiedlichen Erkrankungen wie Epilepsie und Schizophrenie von Bedeutung sein. Da auch die Schmerzverarbeitung durch nikotinische Rezeptoren beeinflusst wird haben in jüngerer Zeit Substanzen, die diese Rezeptoren aktivieren, vermehrt Aufmerksamkeit erhalten. Wir haben im gegenständlichen Projekt nikotinische Rezeptoren im Ganglion Cervicale Superius (SCG) untersucht. Das SCG ist Teil des sympathischen Nervensystems, und nikotinische Rezeptoren im Ganglion sind verantwortlich für die Signalübertragung vom afferenten zum efferenten Nerven (afferente Nerven verbinden das Ganglion mit dem Rückenmark, efferente Nerven stellen die Verbindung vom Ganglion zu Erfolgsorganen wie dem Herzen her). Wir verwendeten das SCG weil bekannt ist, dass die Rezeptoren hier aus einer vergleichsweise geringen Anzahl von Bausteinen ("Untereinheiten") bestehen. Neben Kontrollmäusen haben wir unsere Untersuchungen auch an Gewebe von genetisch veränderten Tieren, denen bis zu drei Untereinheiten fehlen, durchgeführt. Die im Ganglion vorkommenden Rezeptoren hatten daher eine vorhersehbare Zusammensetzung, was unsere Resultate auch bestätigten. Die Experimente sind einzigartig, weil nikotinische Rezeptoren von bekannter Zusammensetzung bisher noch nie in genau dem Gewebe, in dem sie normaler weise vorkommen analysiert wurden. Die drei im Rahmen des Projekts wichtigsten Untersuchungstechniken waren (1) Immunpräzipitation mit Antikörpern, die exakt die Untereinheiten erkennen, gegen die sie gerichtet sind. Wir haben diese Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen selbst erzeugt, gereinigt, und auf ihre Spezifität hin exzessiv getestet. (2) Elektrophysiologische Messungen an Nervenzellen aus den SCGs unserer diversen Mausstämme. Diese Messungen wurden an Zellkulturen durchgeführt. (3) Elektrophysiologische Messungen an intakten Ganglien. Hier wurde der afferente Nerv stimuliert und die elektrische Aktivität des efferenten Nerven gemessen. Mit Hilfe unserer Antikörper konnten wir den Aufbau der ganglionären Rezeptoren nicht nur in den Kontrollmäusen sondern auch in den genetisch manipulierten Tieren exakt bestimmen. Dies versetzte uns in die Lage, Rezeptoren von bekannter Zusammensetzung mit ihrer Funktion bis hin zu Eigenschaften eines einzelnen Ionenkanals in Beziehung zu setzen. Unsere Ableitungen am intakten Ganglion haben uns Einblick gewährt, wie sich die genetischen Manipulationen auf die Informationsübertragung im Ganglion auswirken. Da die Rezeptoren, die wir hier untersucht haben, auch in Gehirngebieten vorkommen, die für die Entstehung der Nikotinsucht verantwortlich sein sollen, erhalten unsere Beobachtungen eine Bedeutung, die über das SCG hinausreicht.