Kapillarelektrophorese von Liposom-Assoziierten Viren

Liposome, kleine, von einer Lipid-Doppelschicht umhüllte Tröpfchen, werden häufig als Modellsystem für zelluläre Membranen verwendet. Im Gegensatz zu Zellen und membranumhüllten Organellen kann ihre Lipidzusammensetzung genau definiert und Membranproteine können mit festgelegter Konzentration eingebaut werden. Aus diesem Grund werden Liposome als ein sauberes System betrachtet, das es erlaubt, Bindungs- und Transportphänomene an der Plasmamembran oder an den Oberflächen zellulärer Vesikel zu studieren. Wir schlagen hier vor Methoden zu entwicklen um Liposome und Proteine, die auf verschiedene Weise an diese Liposomen gebunden wurden, mittels Kapillarelektrophorese zu analysieren und zu charakterisieren. Dieses System wird in weiterer Folge dazu verwendet werden um die Interaktion zwischen Rhinoviren des Menschen (HRVs) und membran-gebundenen Rezeptoren sowie die Freisetzung des viralen Genoms zu untersuchen, Vorgänge, die in vivo an der Plasmamembran und in Endosomen stattfinden. HRVs, die für den Großteil milder Infektionen der oberen Atmungswege verantwortlich sind, verwenden zwei verschiedene Rezeptoren zum Eindringen in die Zelle. Siebenundachzig Serotypen binden das intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), ein Mitglied der Immunoglobulinsuperfamile und 12 HRVs binden Vertreter der low-density lipoprotein receptor (LDLR) Familie, multidomän-multimodulare Proteine. Die Ligandenbindungsdomäne der LDL-Rezeptoren besteht aus einer unterschiedlichen Anzahl imperfekter direkter repeats. Ein lösliches, künstliches Konkatemer aus 5 Kopien des Repeats 3 des very-LDLR bindet HRV2 mit hoher Affinität. Dies deutet darauf hin, dass mehr als ein, aber wahrscheinlich alle 5 Module beteiligt sind und 12 Rezeptormoleküle an die 12 Vertices der ikosaedrischen fünfzähligen Symmetrieachsen binden. In jedem Fall ist unbekannt, wie die genomische RNA nach Endozytose der Viren die Membran durchdringt. Während ICAM-1 die Freisetzung der RNA katalysiert, ist nicht bekannt, ob LDL-Rezeptoren irgendeine Rolle bei der Penetration der RNA ins Cytosol zukommt oder ob sie ausschließlich für den Transport der Viren in die Zelle verantwortlich sind. Wir schlagen hier vor, die enorme Nachweisempfindlichkeit, die geringe Probenmenge und die hohe Analysegeschwindigkeit der Kapillarelektrophorese in Kombination mit der Detektion durch Fluoreszenz für die umfassende Charakterisierung dieser einzelnen Etappen auszunutzen, und zwar unter Verwendung von Rezeptor- tragenden Liposomen. Diese Methodik dient der Bestimmung der Viren, Rezeptoren, viralen Proteine und der genomischen RNA während der Bindung und der RNA-Freisetzung an Membranen.

Liposome, kleine, von einer Lipid-Doppelschicht umhüllte Tröpfchen, werden häufig als Modellsystem für zelluläre Membranen verwendet. Im Gegensatz zu Zellen und membranumhüllten Organellen kann ihre Lipidzusammensetzung genau definiert und Membranproteine können mit festgelegter Konzentration eingebaut werden. Aus diesem Grund werden Liposome als ein sauberes System betrachtet, das es erlaubt, Bindungs- und Transportphänomene an der Plasmamembran oder an den Oberflächen zellulärer Vesikel zu studieren. Wir schlagen hier vor Methoden zu entwicklen um Liposome und Proteine, die auf verschiedene Weise an diese Liposomen gebunden wurden, mittels Kapillarelektrophorese zu analysieren und zu charakterisieren. Dieses System wird in weiterer Folge dazu verwendet werden um die Interaktion zwischen Rhinoviren des Menschen (HRVs) und membran-gebundenen Rezeptoren sowie die Freisetzung des viralen Genoms zu untersuchen, Vorgänge, die in vivo an der Plasmamembran und in Endosomen stattfinden. HRVs, die für den Großteil milder Infektionen der oberen Atmungswege verantwortlich sind, verwenden zwei verschiedene Rezeptoren zum Eindringen in die Zelle. Siebenundachzig Serotypen binden das intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), ein Mitglied der Immunoglobulinsuperfamile und 12 HRVs binden Vertreter der low-density lipoprotein receptor (LDLR) Familie, multidomän-multimodulare Proteine. Die Ligandenbindungsdomäne der LDL-Rezeptoren besteht aus einer unterschiedlichen Anzahl imperfekter direkter repeats. Ein lösliches, künstliches Konkatemer aus 5 Kopien des Repeats 3 des very-LDLR bindet HRV2 mit hoher Affinität. Dies deutet darauf hin, dass mehr als ein, aber wahrscheinlich alle 5 Module beteiligt sind und 12 Rezeptormoleküle an die 12 Vertices der ikosaedrischen fünfzähligen Symmetrieachsen binden. In jedem Fall ist unbekannt, wie die genomische RNA nach Endozytose der Viren die Membran durchdringt. Während ICAM-1 die Freisetzung der RNA katalysiert, ist nicht bekannt, ob LDL-Rezeptoren irgendeine Rolle bei der Penetration der RNA ins Cytosol zukommt oder ob sie ausschließlich für den Transport der Viren in die Zelle verantwortlich sind. Wir schlagen hier vor, die enorme Nachweisempfindlichkeit, die geringe Probenmenge und die hohe Analysegeschwindigkeit der Kapillarelektrophorese in Kombination mit der Detektion durch Fluoreszenz für die umfassende Charakterisierung dieser einzelnen Etappen auszunutzen, und zwar unter Verwendung von Rezeptor- tragenden Liposomen. Diese Methodik dient der Bestimmung der Viren, Rezeptoren, viralen Proteine und der genomischen RNA während der Bindung und der RNA-Freisetzung an Membranen.