Genomdynamik

MicroRNAs (miRNAs), eine Art kleiner nicht kodierender RNAs, die als post-transkriptionelle Regulatoren wirken, spielen auch in Wirt-Pathogen Interaktionen eine wichtige Rolle, vorallem in viralen Infektionen. Während DNA Viren ihre eigenen miRNAs in der Zelle exprimieren, konnte kürzlich gezeigt werden, dass die Replikation des Hepatitis C Virus (HCV), eines einzelsträngigen positiven (ss+)RNA Virus der Familie Flaviviridae, von der in der Wirtszelle exprimierten miRNA 122abhängt [1]. Das ist insoferne bemerkenswert, als dass, während die Wirtszellenerkennung durch die üblichen Erkennungsfaktoren sicher stellt, dass sich der Virus im richtigen Gewebe be?ndet, die Abhängigkeit von einer Zellzustand-spezi?schen miRNA die Virulenz auf einen bestimmten Entwicklungs- oder Differentiationszustand beschränkt. RNA Sekundärstrukturvorhersage im Allgemeinen, und die Struktur viraler Genome im Spetiellen, haben eine lange Tradition am TBI. Wir berechneten also die von Jopling et al. [1] publizierten Daten mit unseren Algorithmen und konnten (i) eine leicht unterschiedliche Bindungsstelle und (ii) ziemlich dramatische Veränderungen in früher vorhergesagten Sekudärstukturen im HCV Genom beobachten [2]. Unsere ersten Ergebnisse lassen vermuten, dass strukturelle Umlagerungen sich durch das gesamte Genom hindurch ausbreiten. Um zu sehen, ob dieser Mechanismus auch bei anderen Mitgliedern der Familie Flaviviridae gefunden werden kann, wandten wir unsere Algorithmen auf das Genom des Tick-borne Encephalitis Virus (TBEV) an. Ein erster Screen durch alle bekannten menschlichen miRNAs (miRBase7.1) ergab ein paar miRNA Kandidaten, die, ähnlich wie bei HCV, ebenfalls zu genomweiten Umstukturierungen führten. Dies wirft folgende Fragen auf: Was passiert mit einer RNA Struktur, wenn eine zweite RNA daran bindet? Angenommen, Strukturänderungen werden induziert, wie wirkt sich diese Dynamik auf die Funktionaliät der RNA aus? Und, sind derartige regulatorische Systeme evolutionär erhalten und damit ein generelles Funktionsprinzip, oder sind sie einzigartige Er?ndungen einzelner Spezies? Frühere Arbeiten konzentrierten sich auf das Auffinden, die Beschreibung und die evolutionäre Konservierung von RNA Sekundärstrukturen. Wir wollen einen Schritt weiter gehen, wie in folgenden Punkten zusammengefasst: 1 suchen nach miRNAs die mit Genomen von RNA Viren interagieren, z.B.: Flaviviridae 2 entwickeln von Algorithmen die eine genomweite Kinetik simulieren 3 untersuchen der Position und Function von vorhergesagten miRNA:viralerRNA Interaktionen 4 aufklären der Rolle der miRNA:viralen RNA Interaktion im Hinblick auf Translation, Replikation und Verpackung des viralen Genomes. References [1] CL Jopling, M Yi, AM Lancaster, SM Lemon, and P Sarnow. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-speci?c microRNA. Science, 309(5740):1577-1581, Sep 2005. [2] C Thurner, C Witwer, IL Hofacker, and PF Stadler. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes. J Gen Virol, 85(Pt 5):1113-1124, May 2004.

Eine relativ neue Erkenntnis, wie Zellen es schaffen, dermaßen viele komplexe Prozesse gleichzeitig innerhalb eines so kleinen Raumes wie dem Zellkompartment zu steuern, war die Entdeckung von micro RNAs (miRNAs). Das sind RNA Moleküle von nur 19 bis 22 Nukleotiden Länge, die sehr effizient und innerhalb sehr kurzer Zeit die Expression von mRNAs stoppen können. Der Prozess der miRNA-Bildung wird von einem Enzym namens Drosha initiiert, und findet im Zellkern statt. Weiters weiß man schon seit einiger Zeit, dass auch Viren, über dieses System in die Funktionen ihrer Wirtszelle eingreifen können. Eine Untergruppe von Viren jedoch, die ihr Genom in Form von RNA an Stelle von DNA speichert, und die kein DNA-Stadium während ihres Lebenscycluses durchläuft, hielt man bisher für unfähig, auf diese Art die Regulierung der Wirtszelle zu manipulieren. Die zentrale Hypothese unseres Projektes war es nun, zu zeigen, dass dies dennoch möglich sein müsste. Es gelang uns eine künstliche miRNA in das Genom eines Virus einzubauen, und diese als funktionsfähige miRNA im Cytoplasma der Zelle nachzuweisen. Das hat nicht nur bewiesen, dass auch RNA-Viren prinzipiell über miRNAs mit Wirtszellen in Verbindung stehen können, sondern auch, dass es möglich ist, an einer bestimmten Stelle im viralen Genom, die sehr variabel und mutationstolerant ist, über eine virale Infektion neue Information gezielt in eine Zelle zu bringen. Ein weiteres zentrales Ziel dieses Projektes war es, das strukturelle Verhalten von großen RNA Molekülen zu studieren. Einzlesträngige RNA kann sich in sich zurück falten und mit sich selbst streckenweise einen Doppelstrang bilden. Dadurch entstehen Strukturen, die gewisse Funktionen ausüben können, so-genannte Stem- Loops. Nun kann aber ein RNA Molekül meistens außer der energetisch günstigsten, noch eine ganze Menge weiterer verschiedener Strukturen annehmen, die bei einfachen minimal free energy (mfE) Berechnungen nicht gesehen werden können. Es gelang uns einen Algorithmus zu implementieren, der es uns erlaubt, Faltungswege von großen RNA Molekülen von bis zu 1500 Nukleotiden zu berechnen. Das umfasst fast alle strukturell wichtigen RNA Moleküle in der Zelle. Damit haben wir jetzt ein Werkzeug, mit dem wir die strukturelle Dynamik von solchen Molekülen beobachten können, das heißt wann, wir können sehen, welche Strukturen wie lange präsent sind, und wann sie wieder verschwinden. Wir können sogenannte Struktur-Fallen finden, das sind thermodynamische Zustände, die das Falten in den energetisch günstigsten Fall erheblich verzögern, oder ihn überhaupt unmöglich machen. Auch können wir es verwenden, um zu sehen, welche Sequenzabschnitte gerade nicht in einem Stem-Loop involviert sind, und daher für Enzyme zugänglich.