NMR Spektroskopische Studien der Protein-Faltungskinetik

Die Untersuchung der Mechanismen mit denen Proteine zu ihren nativen Strukturen falten ist von fundamentalem biologischem Interesse. Proteine werden als Kette von Aminosäuren synthetisiert und müssen zu einer definierten dreidimensionalen Struktur falten um biologische Aktivität zu erlangen. Zusätzlich sind Faltungs- und Entfaltungs- Prozesse mancher Proteine direkt an wichtige biologische Prozesse gekoppelt, wie zum Beispiel der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, der Markierung von Proteinen für bestimmte Zellkompartimente oder dem kontrollierten Protein-Abbau. Desweiteren besteht ein direkter Zusammenhang zwischen fehlerhafter Protein- Faltung sowie der Aggregation von falsch gefalteten Proteinen und einer Anzahl von weit verbreiteten Krankheiten wie Alzheimer oder Typ-II Diabetes. Im vorliegenden Projekt werden wir die Faltungskinetik des Proteins KIX, einer Domäne des Transkriptionsfaktors CBP, untersuchen. KIX faltet zu seiner Struktur, die aus drei a-Helices besteht, über eine partiell gefaltete Zwischenstufe in welcher eine isolierte a-Helix ausgebildet ist, während der Rest des Protein-Backbones und das hydrophobe Core unstrukturiert sind. Wir werden hauptsächlich NMR-spektroskopsiche Relaxations-Techniken verwenden, die eine Untersuchung der Protein-Faltungskinetik unter Gleichgewichtsbedingungen ermöglichen und keine Störung des Faltungs-Gleichgewichts erfordern. Diese Methoden liefern sowohl Daten zur Kinetik des Faltungs-Prozesses, als auch strukturelle Daten in Form von chemischen Verschiebungen. Zur Ergänzung der NMR-spektroskopischen Experimente werden wir verschiedene massenspektrometrische Techniken sowie Mutationstechniken und andere spektroskpoische Methoden verwenden. Durch diese Verknüpfung unterschiedlicher Techniken erhoffen wir uns umfassende Einsichten in kinetische und strukturelle Aspekte der Protein-Faltungskinetik und eine möglichst detaillierte Beschreibung der Faltungs-Mechanismen dieses Proteins.

Im vorliegenden Projekt des Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung FWF wurde der molekulare Faltungs-Mechanismus eines Modellproteins zu seiner dreidimensionalen Struktur charakterisiert. Proteine sind die Arbeitspferde von Zellen, welche die Mehrzahl der lebensnotwendigen chemischen Reaktionen bewältigen. Anfangs in Form von linearen Abfolgen von Aminosäuren synthetisiert, müssen Proteine in ihre definierte dreidimensionale Struktur falten um biologische Aktivität zu erlangen. Untersuchungen zu den Mechanismen der Proteinfaltung sind von fundamentalem biologischen Interesse, vor allem auch angesichts des bekannten Zusammenhangs zwischen fehlerhafter Protein-Faltung und einer Anzahl von weit verbreiteten Krankheiten. MIt Hilfe kernmagnetischer Resonanz (NMR) Spektroskopie in Lösung konnten wir zeigen, dass das Modellprotein KIX (eine Domäne aus dem Transkriptions-Koaktivator CBP) seine Struktur über eine partiell gefaltete Zwischenstufe (ein Faltungsintermediat) erlangt, in welchem ein Teil der nativen Struktur vorhanden ist. Die Verknüpfung von unterschiedlichen experimentellen Ansätzen ermöglichte die Quantifizierung der Reststruktur innerhalb dieser Zwischenstufe. Es konnte gezeigt werden, dass zwei (von drei) strukturellen Segmenten der KIX- Domäne im Faltungsintermediat zumindest partiell formiert sind, während der Rest des Protein-Backbones und das hydrophobe Core unstrukturiert sind. Um eine authentische Beschreibung des Faltungs-Mechanismus unter nativen Bedingungen zu ermöglichen, wurden in diesem Projekt ausschliesslich Techniken verwendet, die eine Untersuchung der Protein-Faltungskinetik unter Gleichgewichtsbedingungen, also ohne Störung des thermodynamischen Gleichgewichts, erlauben. Zusätzlich wurde die dreidimensionale Struktur der KIX-Domäne mittels Massenspektrometrie untersucht. Diese Experimente zeigten, dass die strukturellen Eigenschaften der KIX-Domäne in der Gasphase und somit in Abwesenheit von Wasser erhalten bleiben, insbesondere die Abfolge der Stabilitäten der strukturellen Segmente, welche sowohl in Lösung als auch in der Gasphase ident sind. Die massenspektrometrischen Daten zeigen somit den Erhalt der nativen dreidimensionalen Struktur des KIX-Domäne in der Gasphase auf und weisen auf die strukturellen Eigenschaften des Faltungsingermediates als wesentliche thermodynamische Eigenschaft hin.