Analyse des Otx2 Enhancers in Medaka Fischen

Das Zentralnervensystem von Vertebraten bildet zuerst eine einheitlich röhrenförmige Struktur. Im Laufe der weiteren Differenzierungsprozesse wird diese Neuralröhre Schritt für Schritt weiter unterteilt, allerdings ist wenig bekannt wie die Domänen entlang der anteroposterioren Achse positioniert werden. Zuerst wird das Vorder- und das Mittelhirn vom Rhombenhirn getrennt, was durch Otx Transkriptionsfaktoren gesteuert wird. Für das Maus Otx2 Gen wurde ein hoch konservierter Enhancer isoliert (Otx2FM), der die Expression im Vorder- und Mittelhirn reguliert. In diesem Projekt werden wir die übergeordneten regulatorischen Pathways analysieren, die diesen Enhancer steuern und so die erste Unterteilung der Neuralröhre einleiten. Dafür werden wir zwei Methoden verwenden die für das Fischsystem etabliert sind: Transgene Linien und transiente Injektionsexperimente. So werden stabile transgene Linien verwendet, die Gfp unter Kontrolle des Otx2FM Enhancers exprimieren um Kandidatengene transient zu exprimieren. Der Wnt Signaltransduktionsweg ist bekannt für seine Rolle in der anteroposterioren Achsenentwicklung und ist auch wichtig für Otx2. Bindungsstellen für Tcf/Lef Transkriptionsfaktoren, die wichtig für diesen Pathway sind, wurden in dem Enhancer identifiziert und Mutationsexperimente zeigten einen positiven Effekt. Allerdings haben Missexpressionsexperimente, die den Pathway aktivieren Otx2 reprimiert. Somit stehen derzeit widersprüchliche Aussagen über die Funktion des Wnt Signalling gegenüber. Ein Hauptziel des Projekts ist es daher die genaue Rolle dieses Signaltransduktionsweges bei der Positionierung der einzelnen Domänen während der Hirnentwicklung zu analysieren.

Im Organismus wird die Aktivität von Genen sorgfältig reguliert und ermöglicht so ein Umschalten zwischen verschiedenen genetischen Programmen in unterschiedlichen Regionen des Körpers. Diese gewebsspezifische Expression ist die Grundlage für die Differenzierung der Zellen die so verschiedenste Funktionen ausführen können. Die elementaren Mechanismen dieser Regulation sind bekannt. Regulatorische Elemente in Promotor und Enhancer Regionen integrieren verschiedene Signale, die dann in Aktivierung oder Repression des Gens resultieren. Die Signale werden durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die ihrerseits wieder auf Signale innerhalb und außerhalb der Zellen reagieren. Wir haben die Regulation des Otx2 Gens analysiert. Otx2 ist in frühen Phasen der Embryonalentwicklung im anterioren Teil des Embryos aktiv. Die Funktion in dieser Region ist hoch konserviert und Otx Gene kommen in Insekten genauso vor wie im Menschen. Allerdings werden die Signale die für die Expression des Gens verantwortlich sind noch nicht vollkommen verstanden. Wir haben daher versucht die molekularen Mechanismen der Regulation zu analysieren. Ein Enhancer der für die Expression im anterioren Embryo verantwortlich ist wurde schon früher identifiziert. Enhancer sind Regionen eines Gens, die zusammen mit einem Promotor die Aktivität eines Gens regulieren. Promotoren befinden sich direkt vor einem Gen, währenddem Enhancer in einigem Abstand zu finden sind. Im Otx2 Enhancer wurden schon mehrere Sequenzelemente identifiziert. Dazu gehört eine Bindungsstelle für Otx2 selbst, was auf eine Autoregulation des Gens hindeutet. Zusätzlich sind zwei hochkonservierte Wnt Elemente identifiziert worden. Diese Elemente werden von Tcf/Lef Transkriptionsfaktoren gebunden, die auf Wnt Signale reagieren. Für den Wnt Signalweg ist auch wirklich eine Funktion entlang der anterior/posterioren Achse des Embryos postuliert worden, wodurch eine Regulation des Otx2 Gens im anterioren Teil sehr gut möglich ist. Allerdings ist der exakte molekulare Mechanismus dieser Regulation noch nicht geklärt. Bei der Analyse der Elemente haben wir auch eine Reaktion auf Wnt Signalaktivität gefunden. Beide Elemente wurden von ß-Catenin induziert, welches die Aktivität dieses Signalwegs in der Zelle vermittelt. Die zwei Tcf/Lef Bindungsstellen sind hochkonserviert, sowohl in ihrer eigenen Sequenz, als auch im Kontext mit den benachbarten Sequenzelementen. Unsere Resultate zeigen, dass dieses Arrangement wichtig für die Bildung spezifischer Komplexe ist, die eine hohe Bindung zur DNA aufweisen und so die Wnt Signalaktivität verstärken. Eine selektive Regulation von Otx2 im Embryo durch den Wnt-Signalweg ist daher sehr wahrscheinlich.