Metallothionein-Isoformen und ihre Gene in Helix pomatia

Ziel des vorliegenden Projektantrages ist es, die Hypothese der Metall-spezifischen Anpassung der zwei Metallothionein (MT)-Isoformen (Cd-MT und Cu-MT) aus der Weinbergschnecke (Helix pomatia) sowohl auf Protein-Niveau, als auch auf dem Niveau der Genregulation, zu überprüfen. Hintergrund derartiger Fragestellungen ist die Tatsache, dass die beiden MT-Isoformen zumindest in vivo in Metall-spezifischer Weise induziert werden und die beiden Metalle (Cd2+ und Cu+ ) mit unterschiedlicher Präferenz binden und dabei klar getrennte, Metall- spezifische Funktionen aufweisen. Zur Überprüfung unserer Hypothese möchten wir zwei prinzipiell unterschiedliche Vorgansweisen vorschlagen. Auf der einen Seite soll die Metall-Präferenz der beiden MT-Isoformen nach rekombinanter Expression getestet werden, indem das native Zn-Thionein einer Kombination von Cd2+ und Cu+ exponiert wird, und die daraus entsthendenden Metall-Thiolat-Komplexe mit Hilfe der Photometrie, der CD-Spektroskopie und der Massenspektrometrie stöchiometrisch untersucht werden. Dieser Teil der Arbeit wird in Kooperation mit Prof. Dra. Silvia Atrian und ihrer Arbeitsgruppe am Institut für Genetik der Universität Barcelona (Spanien) durchgeführt werden. Auf der anderen Seite sollen in Innsbruck Untersuchungen zur Metall-spezifischen Genregulation erfolgen. Dabei möchten wir - dank der von uns aufgeklärten Genstruktur der beiden MT-Isoformen - mit transkriptionellen Reportergenen arbeiten, die in Metall-belastete Embryonalzellen von Biomphalaria glabrata (Bge) transfiziert werden sollen (Belastung mit Cd2+, Zn2+ and Cu+ ). Die genomische DNA von Biomphalaria glabrata wird übrigens gerade im Rahmen eines weltweiten Genom-Projektes entschlüsselt. Die Reportergene sollen sich aus dem proximalen Promotor-Abschnitt eines der beiden MT-Gene zusammensetzen, sowie aus einem Reporter, der aus der cDNA der jeweils anderen MT-Isoform (also Cd-MT-Promoter mit Cu-MT-cDNA und umgekehrt), sowie der cDNA des Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) besteht. Durch Mutation (site-directed mutagenesis) sollen die am Promotor vorhandenen Metal Responsive Elements (MREs), sowie in unmittelbarer Nachbarschaft dazu angesiedelte Bindungsstellen für nukleare Transkriptionsfaktoren (vor allem Enhancer und Silencer) sequentiell modifiziert werden. Dadurch wird es möglich sien, die Metall-spezifische Expression der beiden MT- Gene in Abhängigkeit von der jeweiligen Anzahl und Position der MREs, aber auch in Wechselwirkung mit modulierenden (verstärkenden oder hemmenden) Transkriptionsfaktoren zu untersuchen. Die transriptionale Aktivität der Reporter-Konstrukte soll dabei mit Hilfe der Real-Time Detection PCR und anhand der Fluoreszenz des exprimierten Produktes erfasst werden, sodass die quantitativen Daten direkt auf die Zahl der erfolgreich transfizierten Bge-Zellen bezogen werden können. Darüberhinaus soll die cDNA der MTs und des Metal- Transcription Factor von Biomphalaria glabrata aufgeklärt werden.

Pulmonaten (Lungenschnecken) zeichnen sich durch ihre Kapazität zur Stressbewältigung unter stark fluktuierenden Umweltbedingungen aus. Darüber hinaus sind Pulmonaten in der Lage, erhöhte Konzentrationen an toxischen Metallen anzureichern und in ihren Organen zu entgiften. Diese Fähigkeiten verdanken diese Organismen zu einem großen Teil der Expression von Metallothioneinen (MTs), einer Familie ubiquitär vorkommender, Metall- bindender, Stress-aktivierter Proteine. Im Gegensatz zu den aus anderen Tiergruppen bekannten MTs, die zumeist als heterometallische Komplexe vorliegen, können MTs aus Pulmonaten in Form homometallischer Komplexe isoliert werden, wobei eine Isoform (CdMT) vorwiegend mit Cadmium (Cd2+) oder Zink (Zn 2+), eine zweite (CuMT) ausschließlich mit Kupfer (Cu+ ) assoziiert ist. Im Rahmen des vorliegenden Projektes standen im Wesentlichen zwei Fragen im Mittelpunkt. Zum einen sollte geklärt werden, ob und inwieweit die Metall-Spezifität der Cd/Zn- bzw. Cu-bindenden MT-Isoform der Weinbergschnecke (Helix pomatia) auf strukturell bedingte Unterschiede der exprimierten Proteinketten zurückzuführen ist, die im Lauf der Evolution entstanden sind. Zum anderen sollten die wichtigsten Erkennungssequenzen des CdMT-Gens der Weinbergschnecke indentifiziert werden, die als Andockstellen für Transkriptionsfaktoren im Zusammenhang mit ihrer Stress-abhängigen Aktivierung in Frage kommen. Eines der hervorragendsten Ergebnisse ist der Befund, dass Metall-spezifische MT-Isoformen offenbar bei allen Pulmonaten in Form zweier MT-Unterfamilien vorkommen, von denen die eine die CdMT-Isoformen repräsentiert, während die zweite die CuMT-Isoformen umfaßt. Die CdMT-Isoformen spielen eine wesentliche Rolle bei der Cd- Entgiftung, während die CuMT-Isoformen in die homöostatische Regulation des Kupfers im Zusammenhang mit der Hämocyaninsynthese involviert sind. Darüber hinaus besitzen Pulmonaten noch eine dritte MT-Isoform, die heterometallische Mischkompexe zwischen Cd2+ und Cu+ bildet und daher als Cd/CuMT bezeichnet wird. Sie stellt wahrscheinlich eine unspezifische Vorläufer-Form der Metall-spezifischen Isoformen dar, spielt darüber hinaus jedoch eine nur untergeordnete physiologische Funktion, wird konstitutiv exprimiert und liegt in sehr niedrigen Konzentrationen vor. Die zwei Metall-spezifischen MT-Isoformen der Pulmonaten sind offenbar durch wiederholte Genduplikation aus einer unspezifischen Vorläufer-Form hervorgegangen. Alle drei Isoform-Varianten unterscheiden sich in ihrer Primärstruktur ausschließlich in den Aminosäurenpositionen zwischen den hoch- konservierten Cysteinresten, die die Schwefelatome für die Metall-Thiolatbindung zur Verfügung stellen. Das bedeutet, dass die Metall-Spezifität der entsprechenden Isoformen ausschließlich durch Modulation der nicht direkt an der Metallbindung beteiligten Aminosäuren entstanden sein muß. Durch rekombinante Expression von CdMT und CuMT aus Helix pomatia in Metall-supplementierten Kulturen von Escherichia coli konnte dieser Befund dank spektroskiopischer und massenspektrometrischer Analysen bestätigt werden: Rekominantes CdMT bildet nur mit Cd2+ und Zn2+ homometallische, stabile Komplexe, rekominantes CuMT nur mit Cu+ . Nach Transformation in MT-knockout-Hefezellen konnte für beide Isoformen ihre jeweils Metall-spezifische physiologische Funktion bestätigt werden. Auf Gen-Niveau äußert sich die Metall-spezifische Funktion der beiden Isoformen (CdMT und CuMT) dahingehend, dass das CdMT-Gen ausschließlich durch Cd2+-Ionen induziert werden kann, während das CuMT- Gen, in Einklang mit der homöostatischen Funktion des exprimierten Proteins, auf Metallbelastungen jeglicher Art überhaupt nicht reagiert. Jedoch gibt es offenbar interspezifische Unterschiede in den Induktionsmustern, wie ein Vergleich der Promotorregionen der CdMT-Gene zwischen den beiden nahe verwandten Arten Helix pomatia und Cantareus aspersus zeigte. Diese Unterschiede können offensichtlich auf die zwischen den beiden Promotoren divergierende Zahl und Anordnung von Bindungsstellen für Stress-relevante Transkriptionsfaktoren zurückgeführt werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Lokalisation der auf dem Promoter der beiden Gene gehäuft auftretenden MREs (Metal Responsive Elements), die bei der Induktion unter Metall- und Stressbelastung als Andockstellen für Transkriptionsfaktoren dienen. Während bei Vertebraten der wichtigste Transkriptionsfaktor für die Stess-abhängige Transkription der MT-Gene der sogenannte MTF-1 (Metal Responsive Transcription Factor 1) ist, scheint dies bei Mollusken nicht der Fall zu sein. Dies eröffnet neue Perspektiven zur weiteren Erforschung der Stress-Antwort von MT-Genen bei Mollusken.