Katalase Peroxidasen aus den pflanzenpathogenenPilzen

Katalase-Peroxidasen (KatG), die einzigen bifunktionellen Peroxidasen mit sowohl peroxidatischer als auch katalatischer Aktivität, gehören phylogenetisch zur Superfamilie von bakteriellen, pilzlichen und pflanzlichen Hämperoxidasen. Über die Funktionalität und physiologische Rolle eukaryotischer KatGs ist wenig bekannt. Eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen Pflanzen und phytogenen Pilzen wird diskutiert. Mit Hilfe genomischer Analyse neu-sequenzierter pilzlicher Genome wurden für dieses Projekt vier verschiedene KatG Gene aus den phytopathogenen Pilzen Gibberella zeae und Magnaporthe grisea für folgende Untersuchungen ausgewählt: Expressionsanalyse (quantitative PCR in Echtzeit) in Bezug auf Wachstums- und (oxidativen) Stressbedingungen, subzelluläre Lokalisierung, Klonierung und heterologe Expression für umfangreiche kinetische und spektroskopische Untersuchungen (Multi-mixing UV-VIS und Circulardichroismus-Spektroskopie, polarograpische Sauerstoff- und Wasserstoffperoxidberstimmung, Proteinkristallographie). Diese Enzyme aus Ascomyceten gehören zu einer neuen, nicht beschriebenen Gruppe von pilzlichen Hämperoxidasen. Ziel dieses Projekts ist die Aufklärung von Struktur-Funktion Beziehungen der pilzlichen Isoformen in Bezug auf ihre mögliche physiologische Funktion sowie von enzymatischen Unterschieden zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Katalase-Peroxidasen. Zusätzlich besitzt Gibberella zeae KatG01 eine einzigartige C-terminale Fusion mit einer für Cytochrom P450- ähnlichen Domäne. Das Protein könnte eine komplexe Oxidoreduktase mit zumindest drei Funktionalitäten darstellen und es ist geplant sowohl das Fusionsprotein als auch die Cytochrome P450 Domäne spectroskopisch und kinetisch zu untersuchen. Während in KatGs die strukturelle Basis der Wasserstoffperoxid- Dismutationsreaktion zunehmend besser verstanden wird, ist sowohl der Substratkanal bzw. die Bindungsstelle von Einelektronendonoren sowie überhaupt die Natur dieser Peroxidasesubstrate völlig ungeklärt. Um diese Fragen zu klären wird daher, basierend auf die umfangreichen enzymologischen Untersuchungen an den vier Pilz-Enzymen, mit Hilfe gesättigter ortspezifischer Mutagenese an ausgewählten Aminosäuren versucht, die Peroxidase-Aktivität zu manipulieren. Generell ist zu erwarten, dass die Kenntnis der Funktionalität von KatGs in Pilzen einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Mechanismus der Interaktion zwischen Pflanzen und phytogenen Pilzen liefern wird. Zudem könnten diese in Pflanzen nicht vorkommenden Enzyme künftig als mögliche molekulare Interventionspunkte im Schutz gegen die Verbreitung von gefährlichen Pilzen in Getreide eine wichtige Rolle spielen.

Das Forschungsprojekt "Katalase-Peroxidasen aus phytopathogenen Pilzen" war für die Klonierung und Exprimierung von drei neu entdeckten Pilz-katG Genen gewidmet. Die genaue Untersuchung von diesen bifunktionellen Häm-Peroxidasen diente für die Aufklärung ihrer Funktion bei der Abwehr gegen oxidativen Stress. Die Ascomycete-Pilze Magnaporthe grisea und Gibberella zeae - weltbekannte planzliche Pathogene waren ausgewählt, weil beide besitzen katG Gene von zwei unterschiedliche Gruppen. Diese Pathogene von Reis und Getreide verursachen landwirtschaftliche Schaden in Milliarden-höhe weltweit. Wir haben zuerst die native Expression an Protein- sowie mRNA Ebene untersucht. Es hat sich herausgestellt, daß die erste - intrazelluläre katG Gruppe ist eher konstitutiv exprimiert, aber die zweite - extrazelluläre katG Gruppe ist induzierbar nämlich mit verschiedenen Substanzen die oxidativen Stress verursachen können. Wir haben bereits erfolgreich zwei vollstgändige katG gene kloniert und exprimiert: die Magnaporthe grisea KatG1 und Gibberella zeae KatG2. Diese Gene waren in spezial modifizierten Stämmen von E.coli heterolog exprimiert und wir haben hohe Expressionen für beide rekombinante Proteine erreicht. Für MagKatG1 haben wir bis zu 30 mg Protein / L Medium und für GzKatG2 über 10 mg Protein / L geerntet. Die Reinigung von MagKatG1 erfolgte über Metal-Chelat-Affinitäts-Chromatographie mit nachfolgender Molekular Sieb Chromatographie. Die Reinheitszahl vom gereinigten Protein im elektronischem Spektrum Rz = 0.63 entspricht fast100% Häm-Sättigung. Kinetische und thermodynamische Eigenschaften von gereinigter MagKatG1 waren untersucht und mit bakteriellen KatG Enzymen verglichen. Die rekombinante GzKatG2 war in einem speziellem E.coli Stamm exprimiert, der eine erhöhte Frequenz von Protein Disulfid Brücken Bildung eben in Cytosol ermöglicht. Nach der Reinigung über die Metal-Chelat-Affinitäts Säule haben wir eine Reintheitszahl von 0.48 erreichtt und die gereinigte GzKatG2 ist gerade in detailirter Untersuchung für die Lokalisierung von Disulfid- Brücken und also für die Ermittlung von kinetischen und thermodynamischen Daten. Beide produzierte phytopathogene Katalase-Peroxidasen werden auch für die Krystallisationsversuche bereitgestellt. Diese Untersuchungen sollen die spezifische Merkmale von zwei unterschiedlichen Gruppen der pilzlichen KatG auf molekularer Ebene aufklären.