Konjugativer DNA Transport in Gram-positiven Bakterien

Der Transfer von Plasmid DNA mittels bakterieller Konjugation in Gram-negativen (G-) Bakterien war in den letzten Jahrzehnten Gegenstand umfangreicher Studien, während die Mechanismen der Konjugation in Gram- positiven (G+) Bakterien weitaus weniger untersucht worden sind. In den letzten Jahren wurden die kompletten Nucleotid-Sequenzen einiger konjugativer Resistenz-Plasmide von G+ Bakterien bestimmt, die eine modulare Organisation der Transferregionen und eine starke Konservierung von vermeintlichen Transfergenen aufwiesen. Einige dieser Gene weisen Homologien zu Bestandteilen von Typ IV Sekretionssystemen in G- Bakterien auf. Konjugativer Plasmidtransfer und Sekretion von Toxinen von verschiedenen G- (pathogenen) Bakterien laufen nach dem Typ IV Sekretionsmechanismus ab. Die Transferregion des Multiresistenz-Plasmides pIP501, eines "broad-host-range" konjugativen Plasmides aus G+ Bakterien, ist in einem Operon organisiert, das für 15 putative Transferproteine codiert. Im Rahmen dieses Projektes sollen alle 15 Genprodukte exprimiert und gereinigt und auf Löslichkeit und Sekundärstruktur getestet werden. Alle löslichen Proteine werden einem Kristallisations-Screening unterzogen. Proteine, die aus diesen Tests als geeignete Kandidaten für Strukturbestimmung hervorgehen, werden im präparativen Maßstab exprimiert und gereinigt werden. Drei Proteine der pIP501- tra-Region, die Homologien zu Typ IV Proteinen von G- Bakterien aufweisen, eine ATPase, ein "Coupling Protein" und eine vermeintliche lytische Transglykosylase werden funktionell charakterisiert werden. Extensive Kristallisationsversuche werden mit den drei Typ IV homologen Proteinen und anderen Proteinen des tra-Operons durchgeführt werden, für welche anhand von Hefe 2-Hybrid Untersuchungen und Interaktionsstudien (pull-down assay) eine Schlüsselfunktion im konjugativen Transfer postuliert wird. Zur Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den Komponenten des Konjugationssystems werden biophysikalische Methoden verwendet werden. Ziel dieses Projekts ist die funktionelle und strukturelle Charakterisierung der Proteinkomponenten und deren Bedeutung für die Assemblierung eines Typ IV ähnlichen Sekretionssystems in G+ Bakterien.

Typ IV Sekretions-Systeme (T4SS) spielen in vielen Arten Gram-negativer (G-) und Gram-positiver (G+) Bakterien eine wichtige Rolle bei der Übertragung von DNA- oder Protein-Substraten in die Zielzelle. Diese Art "Konjugationsmaschinen" stellen eine große Sub-Familie der T4SS dar und sind in den meisten Bakterienarten für die rasante Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen und anderen Virulenzmerkmalen verantwortlich. Besonders problematisch sind diese Systeme bei pathogenen Stämmen der G+ Bakterien, wo sie den Hauptmechanismus der Multi-Resistenz-Verbreitung in klinisch relevanten Pathogenen darstellen (z.B: in Staphylococci, Streptococci und Enterococci). Ziel dieses Projektes war die Identifikation und Charakterisierung von Schlüssel-Komponenten des T4SS von pIP501, einem Multi-Resistenz-Plasmid von Enterococcus faecalis. Wir konnten drei Hauptkomponenten dieses Sekretions-Systems charakterisieren, deren Funktion auf Grund ihrer Homologie zu Bestandteilen von G- T4SS vorhergesagt wurde. So konnten wir zeigen, dass Orf5 und Orf10 die vorhergesagten Eigenschaften, ATP-Bindung und ATPase-Aktivität, tatsächlich aufweisen. Die putative Transglykosilase Orf7 wies bei Expressionsversuchen Löslichkeitsprobleme auf. Daher wurden die zwei vorhergesagten Domänen (SLT und CHAP) getrennt exprimiert und gereinigt. Beide zeigten Transglykosilase-Aktivität und die CHAP-Domäne wies zusätzlich Amidase-Aktivität auf. In weiterer Folge begannen wir alle restlichen Komponenten des pIP501 T4SS zu exprimieren und die Expressionsprodukte auf Löslichkeit zu testen. Bis jetzt konnten fünf zusätzliche Proteine in hoher Ausbeute und in löslicher Form exprimiert und gereinigt werden. Drei dieser Proteine ergaben Treffer in umfangreichen Kristallisations-Versuchen. Eine Optimierung der Kristallisationsbedingungen erlaubte es uns schließlich, hoch- auflösende Daten für zwei der Proteine zu sammeln (Orf14 und Orf11). Die Strukturaufklärung mittels Schweratom-Methoden ist derzeit im Gange. Ein weiteres Ziel diese Projektes war es, die Interaktionen zwischen den Komponenten des T4SS, die von unseren Kooperations-Partnern mittels der "Yeast-two-hybrid" Methode untersucht wurde, mit Hilfe von komplementären Methoden ("Pull-down Assay", Thermofluor) zu charakterisieren bzw. zu bestätigen. Aus diesen Experimenten ergab sich ein - noch sehr vorläufiges - Modell des T4SS-Komplexes. In Kombination mit den hochauflösenden Kristallstrukturen der T4SS-Komponenten und den biophysischen und enzymatischen Ergebnissen ergibt sich ein erstes Bild vom Konjugations-Apparat eines G+ Bakteriums. Dieses Modell wird zum Verständnis der Mechanismen beitragen, die für DNA-Transfer und Austausch genetischer Informationen innerhalb dieser wichtigen Bakteriengruppe verantwortlich sind. Auf lange Sicht könnte die Aufklärung der 3D-Struktur des T4SS dazu beitragen, Ziele zu identifizieren, die für eine Inhibition der Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen in G+ Pathogenen genutzt werden können.