Funktionelle Analyse des RNS-bindenden Cyclophilin Rct1

Cyclophiline sind Peptidyl-Prolyl cisrans Isomerasen, die in allen Organismen vorkommen und eine wichtige Rolle bei der Proteinfaltung spielen. Vertreter dieser großen Proteinfamilie kommen in allen zellulären Substrukturen vor, wo sie viele Zellfunktionen beeinflussen, wie Proteinreifung, Proteintransport, Rezeptoraktivitäten, Apoptosis, Transkription, Prozessieren von RNA, und Assemblierung vom Spleißosom. Durch ihre Fähigkeit an Prolinen in Proteinen zu binden, wird angenommen, dass sie als molekulare Chaparone wirken können. Der molekulare Mechanismus, wie Cyclophiline diese Aktivitäten beeinflussen, ist noch relativ unbekannt. Rct1 und AtCyp59 sind nukleare Cyclophiline aus S. pombe und Arabidopsis, die, wie auch ihre Orthologe in anderen Organismen, mehrere Strukturdomäne aufweisen. Die Peptidyl-Prolyl cisrans Isomerasedomäne am N- Terminus des Proteins wird von einer RNA Erkennungssequenz und einer Domäne gefolgt, die reich an geladenen Aminosäuren ist. AtCyp59 wurde durch seine Interaktion mit SR Proteinen gefunden, jedoch konnte auch gezeigt werden, dass es mit der C-terminalen Domäne der RNA Polymerase II interagiert. Rct1 ist ein essentielles Gen in S. pombe, interagiert mit der C-terminalen Region von RNA Polymerase II und reguliert deren Phosphorylierung in vivo. Suboptimale Konzentrationen von Rct1 erhöhen die Phosphorylierung, während zu viel Rct1 die Phosphorylierung der CTD erniedrigt. Die erhöhte Phosphorylierung von RNA Polymerase II bewirkt eine Störung der Transkription der Gene. Die Assoziation von Rct1 mit der Transkriptionmaschinerie am aktiven Chromatin lässt eine direkte Rolle in der Regulierung der Transkription vermuten. Wir haben deshalb ein Modell vorgeschlagen, bei der Rct1 die Struktur der C-terminalen Domäne beeinflusst und so die Phosphorylierung der den Prolinen benachbarten Serinen beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Proteine an der Schnittstelle von Transkription und Spleißen wirken. In diesem Projekt soll nun ein integrierter biochemischer und genetischer Ansatz die Bedeutung von Rct1 für die Transkriptionsregulation untersuchen. Die Kernfrage ist die Aufklärung, ob Rct1 direkt durch Strukturänderung die Phosphorylierung der C-terminalen Domäne von RNA Polymerase II beeinflusst, oder ob es die spezifischen Aktivitäten von Kinasen oder Phosphatasen reguliert. Dazu sollen mutante Proteine hergestellt werden, die zeigen sollen, welche Domänen für diese Aktivitäten verantwortlich sind. Zusätzlich sollen weitere Interaktionspartner von Rct1 identifiziert werden. Da Zellen mit einer suboptimalen Konzentration an Rct1 einen starken Phänotyp im Zellwachstum, Zellpolarität und in der meiotischen Regulation aufweisen, sollen weitere Analysen klären, ob Rct1 neben der Transkription noch andere Zellaktivitäten beeinflusst. Da Rct1 das bisher einzige essentielle Cyclophilin ist, sind die Aufklärung seiner Funktion und die Identifizierung der zellulären Aktivitäten, die es beeinflusst, von großem Interesse und sollten neue Erkenntnisse über die Aktivitäten von Cyclophilinen liefern.

In diesem Projekt wurde die Funktion von Rct1, einem multidomänen Cyclophillin von Schizosaccharomyces pombe, analysiert. Folgende Hauptaspekte wurden untersucht: 1. Die Rolle der RNA Polymerase II Transkription und die Verbindung zur pre-mRNA Spleißen und 2. der Anteil einzelner Rct1 Domänen an dieser Verarbeitung. Frühere Arbeiten haben ergeben, dass für S. pombe notwendiges Cyclophillin Rct1 die Phosphorylierung der C- terminalen Domäne (CTD) der RNA Polymerase II (RNAP II) negativ reguliert. Wir konnten nun zeigen, dass Rct1 sowohl mit den RNAP II CTD Kinasen Cdk9 und Lsk1 als auch mit der CTD selber über die peptidyl-prolyl cisrans Isomerase (PPIase) Domäne interagiert. Diese Interaktionen sind wichtig für die Regulation der Cdk9 Aktivität, die zusammen mit korrekten Mengen des Rct1 für die volle RNAP II Transkriptionsaktivität notwendig ist. Zusätzlich dazu hat die Analyse der Acetylierung und Trimethylierung des Histon H3 ergeben, dass Chromatindeaktivierung innerhalb der Transkriptionseinheiten bei Überexpression oder Mangel an Rct1 stattfindet. Unsere Ergebnisse zeigen einen neuartigen Regulationsmechanismus der RNAP II Transkription auf, bei dem Rct1 die Aktivität der Cdk9 Kinase moduliert, die in Verbindung mit CTD-Phosphorylierung und Chromatinmodifizierung steht. Zudem konnten wir zeigen, dass Rct1 mit einer Gruppe von Spliceosom Proteinen interagiert, was einen Beweis für co-transkriptionelle Spleißen der pre-mRNA in S. pombe liefert. Die Analyse von Rct1 Proteinen, denen einzelne Domänen entfernt wurden, hat zusätzlich eindeutig gezeigt, dass die Hauptfunktion des Rct1 durch die PPIase Domäne zustande kommt. Diese Analysen haben auch ergeben, dass Rct1 eine wichtige Rolle im mitotischen Zellzyklus spielt. Cyclophilline sind Proteine, die eine peptidyl-prolyl cisrans Isomerase Aktivität in vitro aufweisen. Es wurde bisher angenommen, dass sie eine wichtige Rolle in vielen Prozessen des Zellzyklus spielen. Allerdings sind die Mechanismen, wie sich Cyclophilline an diesen zellulären Vorgängen beteiligen, nach wie vor größtenteils unbekannt. Unsere Ergebnisse liefern starke Beweise dafür, dass Rct1 ein wichtiger Regulator der RNAP II Transkription sowie einiger anderer Aspekte des mitotischen Zellzyklus ist.