Reverse Genetik bei Influenza C Viren

Influenza A, B, und C Viren, drei verschiedene Unterfamilien der Orthomyxoviren, sind membranumhüllte Viren mit einem einzelsträngigen, segmentierten RNA Genom in Negativstrangorientierung. Infektionen mit Influenza C Viren führen meist zu Erkrankungen der oberen Atemwege. Influenza C Viren sind weltweit verbreitet. Sie können Epidemien verursachen. Im Vergleich zu Influenza A und B Viren sind die molekularen Mechanismen der Infektion durch Influenza C Viren weniger gut untersucht. Für die Untersuchung der Funktionen viraler Gene und deren Proteine wurden für Influenza A und B Viren Methoden der reversen Genetik entwickelt. In diesem Projekt wollen wir ähnliche Methoden entwickeln, um rekombinante Influenza C Viren aus Plasmiden herzustellen. Zunächst soll ein geeigneter Vektor konstruiert werden, in den die sieben RNA-Segmente des viralen Genoms einzeln kloniert werden. Dann werden die sieben verschiedenen Plasmide zusammen in Zellen eingebracht (transfiziert), die die Replikation von Influenza C Viren unterstützen. Ähnlich wie in bekannten Methoden zur Herstellung rekombinanter Influenza A Viren kommt es in geeigneten Zellen zur Transkription der viralen RNA von den Plasmiden, und schliesslich zur Translation, dem Zusammenbau und zur Freisetzung rekombinanter Viren. Um die rekombinanten Viren eindeutig von wild-typ Viren unterscheiden zu können, werden in einem cDNA- Segment mehrere stille Mutationen eingebracht, die durch RT-PCR und Sequenzanalyse nachgewiesen werden können. Sobald die Methode zur Herstellung rekombinanter Viren aus Plasmiden etabliert ist, wollen wir die Funktion des viruskodierten nichtstrukturellen Proteins NS1 mittels reverser Genetik untersuchen. Das NS1 Protein von Influenza A Viren inhibiert die Aktivierung der unspezifischen antiviralen Interferonreaktion durch verschiedene Mechanismen. Die in der Literatur bekannten Daten weisen darauf hin, dass das NS1 Protein von Influenza C Viren ähnliche Eigenschaften haben könnte. Wir wollen deshalb rekombinante Influenza C Viren mit Deletionen im NS1 Gen herstellen und das Replikationsverhalten studieren. Sollte das NS1 Protein für die Unterdrückung der Interferonantwort essenziell sein, nehmen wir an, dass rekombinante Viren mit Deletionen im NS1 Protein stark attenuiert sein müssten und nur in Zellen replizieren können, die einen Defekt in der Aktivierung von Interferon haben. Es gibt mehrere Beispiele dafür, dass gerade Zelllinien, die aus Tumorgeweben isoliert wurden, Defekte in der Interferonantwort aufweisen. In den letzten Jahren konnten wir nachweisen, dass verschiedene Zellen aus menschlichen Tumoren, wie z.B. maligne metastasierende Melanome 9-O-acetylierte Sialinsäure, den Rezeptor für Influenza C Viren, stark überexprimieren. Außerdem haben rund 70% menschlicher Melanome einen Defekt in der Signalübertragung durch Interferon. Dadurch könnten rekombinante Influenza C Viren mit Deletionen im NS1 Gen in der Zukunft sichere und effiziente tumor-lysierende Viren und / oder Vektoren für zielgerichteten Gentransfer darstellen.

Influenza A, B, und C Viren, drei verschiedene Unterfamilien der Orthomyxoviren, sind membranumhüllte Viren mit einem einzelsträngigen, segmentierten RNA Genom in Negativstrangorientierung. Infektionen mit Influenza C Viren führen meist zu Erkrankungen der oberen Atemwege. Influenza C Viren sind weltweit verbreitet. Sie können Epidemien verursachen. Im Vergleich zu Influenza A und B Viren sind die molekularen Mechanismen der Infektion durch Influenza C Viren weniger gut untersucht. Für die Untersuchung der Funktionen viraler Gene und deren Proteine wurden für Influenza A und B Viren Methoden der reversen Genetik entwickelt. In diesem Projekt entwickelten wir ähnliche Methoden, um rekombinante Influenza C Viren aus Plasmiden herzustellen. Zunächst konstruierten wir einen geeigneten Vektor, in den die sieben RNA-Segmente des viralen Genoms einzeln kloniert wurden. Dann wurden die sieben verschiedenen Plasmide zusammen in Zellen eingebracht (transfiziert), die die Replikation von Influenza C Viren unterstützen. Es gelang, die Transkription der viralen Gene von den Plasmiden zu erreichen, die schließlich zur Translation, dem Zusammenbau und zur Freisetzung rekombinanter Viren führte. Sobald die Methode zur Herstellung rekombinanter Viren aus Plasmiden etabliert war, wurde die Funktion des viruskodierten nichtstrukturellen Proteins NS1 untersucht. Wir konnten zeigen, dass dieses Protein der zellulären antiviralen Interferonantwort entgegenwirkt. Durch Expression verkürzter Formen des NS1 Proteins konnten wir weiters bestimmen, welche Regionen dieses Proteins die antivirale Antwort reduziert. Weiters stellten wir fest, dass die Funktion des viralen NS1 Proteins auf zumindest zwei unterschiedlichen Mechanismen beruht. In Zukunft wollen wir die kombinierten Ergebnisse dazu verwenden, rekombinante Viren herzustellen, die ein modifiziertes NS1 Protein exprimieren, welches nicht in der Lage ist, die Interferonantwort zu unterdrücken. Solche Viren können nicht mehr in den Zellen der Atemwege replizieren. Sie sollten aber in der Lage sein, Tumorgewebe (zum Beispiel Melanome) zu infizieren, die den Rezeptor für Influenza C Viren an der Zelloberfläche exprimieren. Solche rekombinanten Viren könnten als Werkzeuge dienen, um spezifisch menschliche maligne metastasierende Melanomzellen zu bekämpfen. Um diese Hypothese zu überprüfen, begannen wir kürzlich eine internationale Zusammenarbeit mit einem auf Melanom- und Brustkrebsforschung spezialisierten Labor in Kanada. Ziel dieser Zusammenarbeit ist die Heilung von Mäusen mit Melanomen.