Samenkonservierung zum Erhalt der Amphibienbiodiversität

Amphibien sind eine Gruppe von Wirbeltieren mit weltweit über 6.000 Arten. Nahezu ein Drittel aller Amphibienarten sind gefährdet. Zurzeit sind verschiedene Versuche im Laufen, um den Rückgang von Amphibien zu verhindern und die Arten zu schützen. Die Kryo-Konservierung von Spermien und eine nachfolgende Androgenese könnte eine weitere Gefährdung von Amphibienarten vermindern. Für dieses Projekt wurden der afrikanische Krallenfrosch Xenopus tropicalis und das Axolotl Ambystoma mexicanum als repräsentative Modelle für Anura beziehungsweise Caudata ausgewählt. Die Auswirkung der Kryo-Konservierung auf die Spermien wird durch die Variation von Samenverdünner und Gefrierschutzmittel sowie von Einfrier- und Auftaurate ausgetestet und standardisiert. Zur Erfolgskontrolle wird die Spermien-Beweglichkeit gemessen, der Anteil toter Spermien und der Zustand des Akrosoms festgehalten und ein Fruchtbarkeitstest durchgeführt. Bei der Andogenese werden UV- Strahlen verwendet um die DNA der Eier zu zerstören. Die Höhe und die Dauer der UV-Bestrahlung werden für beide Amphibienarten ermittelt. Danach werden diese Eier mit gefrierkonservieren Spermien befruchtet. Die Wiederherstellung des diploiden Status wird durch die Anwendung eines Hitzeschocks gewährleistet, dessen genaue Temperatur und Einwirkungszeit ausgetestet wird. Eine heterozygote Androgenese, bei der der diploide Status durch die Verschmelzung von Chromosomen gewährleistet wird, wird ebenfalls angewendet. Zusätzlich wird getestet, ob gefrorene Spermien von Xenopus tropicalis und Ambystoma mexicanum die genetisch zerstörten Eier von Xenopus laevis und Ambystoma tigrinum befruchten können. Dies ist eine Basis für die Befruchtung eines Eies einer Art mit Spermien einer verwandten Art, die gefährdet oder geschützt ist. Der Erfolg der Androgenese- Experimente wird einerseits durch die Überlebensrate der Kaulquappen und andererseits durch die Untersuchung der genetischen Zusammensetzung mit Hilfe der Mikrosatelliten-Technik kontrolliert.

Amphibien sind eine eigenständige Gruppe von Vertebraten, welcher weltweit über 6000 bekannte Arten angehören. Fast 1/3 (32%) der weltweiten Amphibien sind bedroht, was 1856 Arten betrifft, wobei bereits 168 Arten verschwunden sind. Zusätzlich sind zuletzt 2469 (43%) der Arten in ihrer Population rückläufig, was zeigt, dass die Zahl der bedrohten Arten weiter steigen wird. Der genaue Grund für den Amphibienrückgang ist nicht bekannt. Allerdings gibt es einige Hypothesen, welche eigenständig oder im Zusammenhang mit anderen bestehen. Diese Ursachen beinhalten generelle Faktoren der weltweiten Biodiversitätskrise durch Habitatszerstörung, -umbau und -zerteilung, eingeschleppte Arten, Ausbeutung, Klimawandel, erhöhter UV Strahlung, chemische Kontaminationen mit biologisch aktiven Substanzen und das aufkommenden von Infektionskrankheiten wie z.B. Chytridiomycosis,. Die Kryokonservierung und Anwendung von genetischen Veränderungen der konservierten Spermien haben ein großes Potential als kurzzeitige Lösung zur Erhaltung der Genome von bedrohen und verschwundenen Amphibienarten. Darum wurde in dem vergangen Projekt versucht, Samen nach der Kryokonservierung genetisch zu manipulieren und eine Genbank zu erstellen, um damit bei bedrohten Amphibienarten ein entgegenwirken zu ermöglichen.Wir haben hauptsächlich an 2 Modellen gearbeitet, dem Afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) als Modell für Anura und dem Axolotl, Ambystoma mexicanum als Model für Caudata. Wir konnten erfolgreich ein vollständiges Protokoll zur Kryokonservierung von X. laevis Spermien entwickeln und die Beweglichkeit nach dem Auftauen mittels einem Computer sperm motility Programmes abschätzen, wobei in der Fluoreszenz und der Beweglichkeit unterschieden wurde. In diesem Protokoll konnten wir erfolgreich die Verdünnungsmittel und Füllmittel, sowie die Einfrier- und Auftauschritte festlegen. Außerdem entwickelten wir erfolgreich ein weiteres Protokoll um Spermien des heimischen Europäischen Frosches (Rana temporaria) zu aktivieren und dies kryo zukonservieren. Ausgehend von diesen Experimenten haben wir festgestellt, daß es für jede Froschluchart ein spezielles eigenes Kryokonservierungsprotokoll geben muss, welches die Aspekte der Samenverdünnung und eingesetzten Kryoprotektanzen für jede Art festlegt. Ein Protokoll für jeden Frosch ist unpraktikabel. Bei den Axolotl (A. mexicanum), konnten wir zum ersten Mal erfolgreich fertile Samen und Eier gewinnen ohne das Tier töten zu müssen. Außerdem wurde erfolgreich ein Protokoll zur in-vito Befruchtung entwickelt. Zusätzlich wurde das Samengewinnungsprotokoll an heimischen Uramphibien, wie dem Feuersalamander (Salamanadra salamandra), Kammmolch (Triturus cristatus) und Teichmolch (Lissotriton vulgaris) getestet. Nebst diesem wurde die Spermien Feinstruktur und das Motilitätsverhalten untersucht, sowie Versuche durchführt um die Androgenesetechniken bei Axolotl anwenden zu können. Zu letzt wurde eine Untersuchung zur Spermien Beweglichtsaktivierung und - verlängerung und des Metabolismus der Spermienzelle im Urin des Seefrosches (Pelophylax ridibundus) durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Projektes haben einen großen Nutzen die Reproduktionsbiologie von Amphibien zu verstehen und eröffnen ein neues Feld für weitere Forschungs- und Konservierungsmethoden.