Isolierung von MMTV und MLV mRNA Regulationsproteinen

Retroviren besitzen spezifische Mechanismen um ungespleißte bzw. unvollständig gespleißte Virus-RNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma zu transportieren. Komplexe Retroviren nutzen dazu akzessorische, viral-kodierte Regulatorproteine die an sogenannte responsive elements in der viralen RNA binden und damit den RNA-Export einleiten. In einfachen Retroviren interagiert ein cytoplasmatisches Transportelement (CTE) auf der viralen RNA mit zellulären Transportproteinen. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, das mouse mammary tumourVirus (MMTV) zur Gruppe der komplexen Retroviren zu zählen, da in unserem Labor und in anderen Arbeitsgruppen ein neues, akzessorisches MMTV-Protein beschrieben wurde, das als Regulator der MMTVExpression "Rem" bezeichnet wird. Experimentelle Analysen, darunter eigene unpublizierte Daten, deuten darauf hin, daß Rem eine Rolle beim Export der MMTV-RNA aus dem Zellkern spielt. Die Identifikation des entsprechenden responsive elements bzw. die Isolierung des Rem-Proteins aus MMTV-infizierten Zellen ist allerdings noch Gegenstand intensiver Forschung. Seit langem wird über die Existenz eines cytoplasmatischen Transportelements (CTE) zum Export ungespleißter viraler RNA aus dem Kern bei dem murinen Leukämievirus (MLV), einem einfachen Retrovirus, spekuliert. Bisher konnte allerdings weder ein solches Element noch ein anderer nukleärer Exportmechanismus für MLV beschrieben werden. Ziel des hier vorgeschlagenen Projekts ist es daher, zum einen MMTV-Rem bzw. Remassoziierte Wirtszellproteine zu isolieren und zu identifizieren, zum anderen die Existenz eines CTE in MLV zu prüfen. Die methodische Grundlage dafür bildet eine modifizierte "StreptoTag"-Technologie, mit der, beruhend auf Affinitätschromatographie, RNA-bindende Proteine aus komplexen Proteinmischungen isoliert werden können. Vor kurzem wurde von uns ein Protokoll entwickelt, das es ermöglicht "StreptoTag"-markierte RNA in eukaryonten Zellen zu exprimieren und aus dem Zellextrakt aufzureinigen. Im weiteren soll nun "StreptoTag"- markierte virale RNA im Komplex mit ihrem natürlichen Bindungspartner Rem aus MMTV-infizierten humanen und murinen Zellen isoliert werden. Darüber hinaus sollen die zellulären Bindungspartner des MLV CTE durch "StreptoTag"-Markierung der RNA replikationskompetenter MLV-Vektoren identifiziert werden. Der Nachweis einer spezifischen Interaktion der viralen RNA mit zellulären Proteinen würde einen substantiellen Beitrag zum Verständnis der Biologie von MMTV und MLV liefern.

RNA-Protein Interaktionen spielen eine Schlüsselrolle in fundamentalen zellulären Prozessen aller lebenden Organismen. Sie sind insbesondere in pathogenen Netzwerken wie z.B. Virus-Wirtszell Interaktionen von Bedeutung und folglich von besonderem Interesse. Eine Reihe in vitro basierender Methoden für die Isolierung RNA-bindender Proteine sind bereits etabliert; diese führen jedoch oftmals zur Isolierung von Artefakten, da diese Interaktionen unter physiologischen Bedingungen in der Zelle nicht auftreten würden. Die im Rahmen dieses Projektes etablierte in vivo StreptoTag Methode basiert auf der Interaktion speziell modifizierter RNA Moleküle mit viralen bzw. zellulären Proteinen in vivo, d.h. innerhalb einer Zelle. Die hier gebildeten RNA/Protein Komplexe werden mit Hilfe einer hoch spezifischen Affinitätschromatographie-basierten Methode isoliert und gereinigt und können im Folgenden z.B. mittels Massenspektroskopie charakterisiert werden. Im bearbeiteten Projekt wurde diese Methode am Beispiel der gut definierten RNA/Protein Interaktion des humanen Immundefizienzvirus (HIV) etabliert und die Funktionalität des Systems bestätigt. Anschließend wurde die Methode verwendet, um bislang weniger bekannte RNA/Protein Interaktionen des Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) zu analysieren, das bei Mäusen zur Bildung von Brusttumoren führt und auch menschliche Zellen infizieren kann. Hierbei konnte eine bislang vermutete Bindung des viralen Rem Proteins an eine spezielle Region der viralen RNA nachgewiesen und die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion für deren Export aus dem Zellkern gezeigt werden. Schließlich gelang mit Hilfe dieser Methode die Isolierung eines bislang nicht beschriebenen zellulären Proteins das vermutlich an der Regulation der MMTV Genexpression beteiligt ist.