S-Schicht Lipidmembranen für den Einbau von Membranproteinen

Die Entschlüsselung vom Genom vieler Organismen hat gezeigt, dass ca. ein Drittel aller Genprodukte Membranproteine sind. Transmembran (TM) Proteine und periphere Proteine werden bei vielen Krankheiten angegriffen und sind daher bevorzugte Wirkungsstätten für Arzneien (mehr als 60% aller verschriebenen Medikamente wirken derzeit auf diese Proteine). Wegen der bedeutenden Funktionen der TM Proteine stellen Modellmembranen wichtige Systeme dar um fundamentale zelluläre Prozesse zu studieren und um Pathogene oder Wirkstoffe herauszufiltern. Im vorliegenden Projektantrag wird ein neuer Typ von festkörperunterstützten Membranen untersucht. Dabei wird der Festkörper (Sensor oder Elektrode) mit einem bakteriellen zweidimensionalen Proteinkristall (S-Schicht) überzogen und daran wird die Lipidmembran gebunden. S-Schicht unterstützte Lipidmembranen sind biomimetische Strukturen, die das supramolekulare Prinzip des Aufbaus der Zellwand von Archaea, die im Zuge der Evolution über Millionen von Jahren unter extremsten Bedingungen optimiert wurde, nachahmt. Für die Membranherstellung wird keine Apertur verwendet sondern kugel-, scheibchen- und zylinderförmige Lipidkonstrukte werden über elektrostatische oder spezifische Wechselwirkungen am S-Schichtgitter gebunden und fusioniert um planare Membranen herzustellen. Die S-Schicht dient dabei als stabilisierender Unterbau für Membranen bestehend aus Phospholipiden und Tetraetherlipiden oder Mischungen davon, Anbindungsstruktur, Abstandhalter zum Festkörper, als Ionenreservoir und, wenn sie als zweite Schicht auf der Membran aufgebracht wird, als nanoporöse Schutzschicht. Die S-Schicht unterstützten Lipidmembranen werden hinsichtlich ihrer strukturellen und dynamischen Eigenschaften, Langzeitstabilität und Fluidität in Abhängigkeit der Herstellungsmethode und Anbindungsstrategie charakterisiert werden. Durch Anwendung der S-Schicht Technologie ist zu erwarten, dass die Langzeitstabilität von fluiden Lipidmembranen wesentlich erhöht werden kann. Das große Ziel ist der Einbau von funktionellen Ryanodin Rezeptoren-Kalziumkanälen, nikotinischen Acetylcholinrezeptoren und a-Hämolysin. Diese TM Proteine wurden wegen ihrer klinischen Bedeutung, Verfügbarkeit von endogenen Liganden und Antikörpern, unterschiedlichen Membran-durchspannenden Strukturen und verfügbaren Literaturdaten ausgewählt. Es sind auch Einzelkanalmessungen für die in S-Schicht unterstützten Lipidmembranen eingebauten TM Proteine vorgesehen. Dieses Projekt wird Systeme zur Untersuchung von TM Proteine unter kontrollierbaren Bedingungen entwickeln. Dies ist nicht nur von großer Bedeutung im Bereich der Grundlagenforschung sondern auch für Screening- Verfahren nach Pathogenen oder Wirkstoffen und für die Entwicklung von auf TM Protein-basierenden Biosensoren.

Künstlich nachgebaute Lipidmembranen sind interessante Modellsysteme, um die Strukturen von Zellhüllen aufzuklären und vor allem deren Wechselwirkung mit Membran-aktiven Peptiden (MAPs) und Membranproteinen (MPs) zu studieren. Das Neue an diesem vorliegenden Projekt ist die Nutzung eines kristallinen bakteriellen Proteins (genannt Oberflächen (Surface)-Schichtprotein) als biomimetischer Abstandshalter zwischen festen Trägern (z.B. Mikroelektroden oder Sensor Oberflächen) und Lipidmembran. Die wichtigste Funktion von Lipiden ist eine Barriere aufzubauen, die einerseits den Ionenfluss unterbindet und andererseits über MAPs und MPs spezifisch steuert. Zudem ist die Aufgabe des SSchichtproteins eine Struktur für die Verankerung der Lipidmembran an einem festen Träger zu gewährleisten, aber auch die notwendige Fluidität und den erforderlichen Raum, vor allem für integrale MPs, zur Verfügung zu stellen. Da die Membranbildung erstmals ohne zur Hilfenahme einer makroskopischen Polymerfolie als Eingrenzung möglich war, stellen diese neuartigen Modelllipidmembranen einen wichtigen Schritt in Richtung Vereinfachung und Miniaturisierung dar. Diese macht es möglich, Untersuchung von biologischen Funktionen wie z.B. MPs und MAPs mittels hochauflösenden bildgebenden Oberflächen-sensitiven und elektrochemischen Methoden durchzuführen.Zwei Strategien zur Herstellung einer S-Schicht unterstützten Lipidmembran wurden erfolgreich entwickelt und somit ist es möglich, unterschiedliche biologisch relevante Fragen zu beantworten. Diese S-Schicht unterstützten Lipidmembranen zeigen sowohl eine hohe elektrische Isolationseigenschaft als auch eine erhöhte Fluidität, so dass MAPs und MPs erfolgreich eingebaut und charakterisiert werden können.Membranproteine sind sehr wichtige Biomoleküle, wie die Tatsache zeigt, dass ein Drittel aller Proteine MPs sind, viele von diesen sind direkte Angriffspunkte für hochwirksame Medikamente. Heute wirken mehr als 60% aller verschriebenen Medikamente auf MPs wie porenbildende Proteine, Ionenkanäle oder Rezeptoren. Es wird erwartet, dass in naher Zukunft die Bedeutung von MPs in der Medizin, Pharmakologie, aber auch in Sensorsystemen (z.B. künstliche Nase, etc.) rasch zunehmen wird, da immer mehr Informationen über deren Struktur und Funktion zur Verfügung stehen werden.Mit diesem Projekt konnte nicht nur ein Machbarkeitsnachweis bezüglich des Einbaus und funktioneller Charakterisierung von porenbildenden Proteinen und Rezeptoren erbracht werden, sondern es bietet auch interessante Einblicke in den Mechanismus der Insertion von (antimikrobiellen) MAPs in Modelllipidmembranen. Zudem konnten mögliche Anwendungen im Bereich der medizinischen und technischen Forschung sowie neuer bildgebenden Technologien aufgezeigt werden. Die erhaltenen Ergebnisse können z.B. für die Produktion von Hochdurchsatz Screening Geräte für die Diagnostik und die Pharmakologie, aber auch zur Entwicklung von neuartigen Biosensoren, die auf MPs basierten, verwendet werden.