UDP-Glucuronsäure Pyrophosphorylase

Die Zellwände von Pflanzen bestehen neben den Cellulosefibrillen zu einem großen Teil aus Matrixpolysacchariden, zu denen die Pektine und die Hemicellulosen zählen. Diese Polymere werden überwiegend aus einer gemeinsamen Vorstufe (UDP-Glucuronsäure) gebildet, die für die untersuchte Modellpflanze Arabidopsis thaliana etwa 50% der Zellwandbiomasse liefert. Zwei Biosynthesewege für UDP-Glucuronsäure sind in Arabidopsis bekannt. Beide Synthesewege starten mit einer energetisch irreversiblen Eingangsreaktion aus dem zellulären Zuckerstoffwechsel. Hierdurch wird eine Metabolitenverteilung zwischen der Bildung von Reservestoffen einerseits und Zellwandpolymeren andererseits kontrolliert. Wir wollen in diesem Projekt ein Enzym des (aus den meisten Biochemiebüchern unbekannten) myo-Inosit Oxidationsweges untersuchen, das die terminale Synthese der UDP-Glucuronsäure aus UTP und Glucuronsäure-1-phosphat katalysiert. Eine zweite wichtige Funktion könnte das Recycling von Zuckern sein. Diese beiden Hauptfunktionen werden in verschiedenen genetischen Komplementationsansätzen funktionell getestet. Eine Insertionsmutante in dem Gen für diese Pyrophosphorylase ist lethal für die Pollenentwicklung. Dieser Phänotyp kann mit den bisherigen Vorstellungen über den Stoffwechsel von Nukleotidzuckern nur schwer erklärt werden. Durch eine Kombination aus zellbiologischen, biochemischen und genetischen Ansätzen soll untersucht werden, welche Funktion das Enzym für die normale Entwicklung von Arabidopsis hat. Mit verschiedenen DNA- Konstrukten sollen heterozygote Mutanten in dem Gen für die Pyrophosphorylase komplementiert werden. Die Zellwände der Mutanten sollen durch Elektronenmikroskopie und Immun-Lichtmikroskopie mit monoklonalen Antikörpern gegen Zellwandepitope vertiefend charakterisiert werden. Diese Untersuchungen werden durch biochemische Analysen von Zellwänden (und Polymeren daraus) vervollständigt. Dabei wird auch untersucht, warum keine Kompensation dieses Defekts durch den zweiten (Haupt)-Biosyntheseweg für UDP-Glucuronsäure durch das Enzym UDP-Glucose Dehydrogenase erfolgt. Das Projekt sollte auch neue Erkenntnisse zur Synthese von Ascorbat liefern, und klären, in wie weit ein Syntheseweg zum Ascorbat ähnlich wie in Tieren auch innerhalb von Arabidopsis funktionell ist.

Wir untersuchen die Frage, wie Sonnenenergie aus Produkten der Photosynthese dauerhaft in Pflanzen gespeichert werden kann und damit als Nahrungsmittel oder Rohstoff dem Menschen und dem Ökosystem zur Verfügung steht.Zucker sind Bausteine für Zellwände in Pflanzen, aber auch für Bindegewebe in Tieren und beim Menschen. Wir untersuchen die Bereitstellung von chemisch aktivierten energiereichen Zuckern (Nucleotidzucker) durch die Zelle, mit denen die angesprochenen Polysaccharide synthetisiert werden können. In krautigen Pflanzen wird ca. 50% der Zellwandbiomasse aus dem Nucleotidzucker UDP-Glucuronsäure gebildet. Hierfür gibt es zwei parallele Synthesewege. Der letzte Schritt des weitgehend unbekannten Synthesewegs über myo-Inosit wurde im Projekt mit biochemischen, zellbiologischen und molekularen Methoden untersucht. Das Enzym wird als UDP-Zucker Pyrophosphorlyase (USP) bezeichnet. Eine Mutante mit einem Defekt in der USP entwickelt keine fertilen Pollen und ist daher nicht lebensfähig. Mit genetischen Methoden wurde versucht, die möglichen Defekte zu umgehen und aufzuheben. Als einziger erfolgreicher Ansatz ergab sich ein Weg, bei dem die Aktivität der USP mit einer Restaktivität von 3-5% der ursprünglichen Aktivität vorhanden bleibt. Über diesen genetischen Ansatz konnte herausgefunden werden, dass die Rolle der USP nicht wie zunächst vermutet hauptsächlich in der Bereitstellung von UDP-Glucuronsäure liegt, sondern eine Beteiligung an Recyclingprozessen eine essentielle Funktion des Enzyms darstellt. Dabei wurden die Recyclingwege für die Zucker Arabinose und Xylose als wichtige Funktion für die USP identifiziert. Aus den Experimenten konnte weiterhin abgeleitet werden, dass die Kompartimentierung der Nucleotidzucker-Biosynthese innerhalb der Zelle von wichtiger Bedeutung ist. Die Recyclingwege finden nach bisheriger Kenntnis im Cytoplasma statt, währen die Neusynthese weitgehend auf den Golgi-Apparat beschränkt ist. Änderungen in der Syntheseleistung in den beiden Wegen wirken sich deutlich unterschiedlich aus. Dieser unerwartete Befund muss zukünftig nochmals aufgegriffen und weiter bearbeitet werden.