Einzelmolekül-Messungen in Lösung mittels FCS/FCCS

Die Fluoreszenz eines Einzelmoleküls kann von dem unspezifischen Hintergrundsignal, das mit einem Femtoliter Meßvolumen assoziiert ist, unterschieden werden. Bei einer Konzentration von etwa 1 nM ist die Wahrscheinlichkeit, daß sich ein Einzelmolekül im konfokalen Meßvolumen befindet, kleiner als eins. Obwohl die Fluoreszenz von Einzelmolekülen gemessen wird, werden die Meßdaten durch eine Auto- order Zweifarben Kreuz- Korrelationsfunktion analysiert, die der Durchschnitt von tausenden Molekülen ist. Eigenschaften von Einzelmolekülen werden so nicht mittels FCS und Zweifarben-FCCS erhalten. Wir wollen erstmals den Weg für biophysikalische Untersuchungen in einem Reaktionsmilieu beschreiten, das das ideale Milieu für Zellbiologen und Kliniker ist, indem wir Einzelmolekül-Messungen direkt in Lösung ohne Immobilisierung oder hydrodynamische Fokussierung ermöglichen, um die Dynamik von einzelnen Partikeln bei Messzeiten zu erfassen, die bisher nicht möglich sind. Die Messung eines biologischen Prozesses in einer lebenden Zelle mit einer entsprechenden räumlichen und zeitlichen Auflösung ermöglicht das grundlegende Verständnis biologischer Prozesse. Die Forschungsarbeit beinhaltet die Entwicklung einer neuartigen Analysetechnik für die Einzelmolekül- Spektroskopie. Das Konzept für längere Meßzeiten wird es ermöglichen, frei in Lösung diffundierende Einzelmoleküle nicht nur weit über den Millisekundenbereich hinaus sondern auch ohne Immobilisierung an künstlichen Oberflächen oder hydrodynamische Fokussierung zu beobachten. Der Plan des Projektes ist der folgende: Ist es statistisch möglich, ein und dasselbe Molekül mehrfach zu erkennen, wenn es durch das kleine, konfokale Meßvolumen diffundiert? Wenn dem so ist, dann kann die Beobachtungszeit eines individuellen Moleküls, das frei in Lösung diffundiert, ausgedehnt werden. Dafür ist das Verständnis der Bilanzierung zwischen der Zeitskala, der Wiedereintrittshäufigkeit in das Meßvolumen und der makroskopischen Zeit, die für die Messung notwendig ist, entscheidend. Das Forschungsprojekt wird zu einem besseren Verständnis theoretischer und experimenteller Grundlagen von Einzelmolekülanalysen in Lösung sowie ihrer biologischen und medizinischen Anwendungen beitragen. Originalität und Innovation der Forschungsarbeiten liegen in der strikten Verbindung vom neusten Entwicklungen in der Mikroskopie und Spektroskopie mit physiologischer Bedeutung. Die neuen Ideen werden übergreifend dargestellt. Mögliche Anwender sind z.B. in der Gentechnologie. Weiters ist dieses Konzept für zahlreiche medizinische, pharmazeutische und bio-chemische Labors von Interesse. Es könnte auch zur Fundierung weiterer Arbeiten auf dem Gebiert der Einzelzellbiologie dienen. Die beteiligten Partner sind in ihren Forschungsgebieten international als hoch kompetitiv ausgewiesen. Wir beabsichtigen ein gemeinsames, koordiniertes Forschungsvorhaben mit Untersuchungen auf molekularer bis zur systemischen Ebene, die theoretische und experimentelle Methoden einbinden und verschiedene Gebiete umfassen, von der Laserspektroskopie und Biophysik bis hin zur Mathematik und Biochemie. Unser Vorhaben ist auf das Erbringen und die Interpretation experimenteller Daten der gewählten DNA und Proteinmodelle gerichtet. Der Partnerverbund bietet die einzigartige Gelegenheit, ein führendes Zentrum für diese Studien aufzubauen. Ohne die beantragte Förderung ist die Vernetzung zwischen den Partnern ISS und MUG nicht möglich und alle Anstrengungen werden verzögert. Die theoretischen Methoden werden getrennt entwickelt und der Vergleich mit experimentellen Ergebnissen wird auf andere Gruppen warten müssen, die die notwendigen Daten entwickeln.

Die Fluoreszenz eines Einzelmoleküls kann von dem unspezifischen Hintergrundsignal, das mit einem Femtoliter Meßvolumen assoziiert ist, unterschieden werden. Bei einer Konzentration von etwa 1 nM ist die Wahrscheinlichkeit, daß sich ein Einzelmolekül im konfokalen Meßvolumen befindet, kleiner als eins. Obwohl die Fluoreszenz von Einzelmolekülen gemessen wird, werden die Meßdaten durch eine Auto- order Zweifarben Kreuz- Korrelationsfunktion analysiert, die der Durchschnitt von tausenden Molekülen ist. Eigenschaften von Einzelmolekülen werden so nicht mittels FCS und Zweifarben-FCCS erhalten. Wir wollen erstmals den Weg für biophysikalische Untersuchungen in einem Reaktionsmilieu beschreiten, das das "ideale" Milieu für Zellbiologen und Kliniker ist, indem wir Einzelmolekül-Messungen direkt in Lösung ohne Immobilisierung oder hydrodynamische Fokussierung ermöglichen, um die Dynamik von einzelnen "Partikeln" bei Messzeiten zu erfassen, die bisher nicht möglich sind. Die Messung eines biologischen Prozesses in einer lebenden Zelle mit einer entsprechenden räumlichen und zeitlichen Auflösung ermöglicht das grundlegende Verständnis biologischer Prozesse. Die Forschungsarbeit beinhaltet die Entwicklung einer neuartigen Analysetechnik für die Einzelmolekül- Spektroskopie. Das Konzept für längere Meßzeiten wird es ermöglichen, frei in Lösung diffundierende Einzelmoleküle nicht nur weit über den Millisekundenbereich hinaus sondern auch ohne Immobilisierung an künstlichen Oberflächen oder hydrodynamische Fokussierung zu beobachten. Der Plan des Projektes ist der folgende: Ist es statistisch möglich, ein und dasselbe Molekül mehrfach zu erkennen, wenn es durch das kleine, konfokale Meßvolumen diffundiert? Wenn dem so ist, dann kann die Beobachtungszeit eines individuellen Moleküls, das frei in Lösung diffundiert, ausgedehnt werden. Dafür ist das Verständnis der "Bilanzierung" zwischen der Zeitskala, der Wiedereintrittshäufigkeit in das Meßvolumen und der "makroskopischen" Zeit, die für die Messung notwendig ist, entscheidend. Das Forschungsprojekt wird zu einem besseren Verständnis theoretischer und experimenteller Grundlagen von Einzelmolekülanalysen in Lösung sowie ihrer biologischen und medizinischen Anwendungen beitragen. Originalität und Innovation der Forschungsarbeiten liegen in der strikten Verbindung vom neusten Entwicklungen in der Mikroskopie und Spektroskopie mit physiologischer Bedeutung. Die neuen Ideen werden übergreifend dargestellt. Mögliche Anwender sind z.B. in der Gentechnologie. Weiters ist dieses Konzept für zahlreiche medizinische, pharmazeutische und bio-chemische Labors von Interesse. Es könnte auch zur Fundierung weiterer Arbeiten auf dem Gebiert der Einzelzellbiologie dienen. Die beteiligten Partner sind in ihren Forschungsgebieten international als hoch kompetitiv ausgewiesen. Wir beabsichtigen ein gemeinsames, koordiniertes Forschungsvorhaben mit Untersuchungen auf molekularer bis zur "systemischen" Ebene, die theoretische und experimentelle Methoden einbinden und verschiedene Gebiete umfassen, von der Laserspektroskopie und Biophysik bis hin zur Mathematik und Biochemie. Unser Vorhaben ist auf das Erbringen und die Interpretation experimenteller Daten der gewählten DNA und Proteinmodelle gerichtet. Der Partnerverbund bietet die einzigartige Gelegenheit, ein führendes Zentrum für diese Studien aufzubauen. Ohne die beantragte Förderung ist die Vernetzung zwischen den Partnern ISS und MUG nicht möglich und alle Anstrengungen werden verzögert. Die theoretischen Methoden werden getrennt entwickelt und der Vergleich mit experimentellen Ergebnissen wird auf andere Gruppen warten müssen, die die notwendigen Daten entwickeln.