Transkriptionelle Kontrolle der Musterbildung im Zebrafisch

Nodal und BMP Signalmoleküle aus der Familie der TGF-beta Faktoren haben essentielle Funktionen in der Wirbeltierentwicklung. Im Rahmen der Frühentwicklung steuern sie die Musterbildung und sind dabei unter anderem für die Induktion der Keimblätter Mesoderm und Endoderm verantwortlich. In diesem Projekt werden wir untersuchen, wie durch Wechselwirkung der konservierten Transkriptionsfaktoren Ntl, FoxH1 und Mixer die Umsetzung dieser TGF-beta Signale reguliert sind. Sowohl Nodal als auch BMP Signale wirken als Morphogene im Embryo, d.h. je nach Signalstärke induzieren sie unterschiedliche Zellschicksale. Nicht bekannt ist jedoch, wie die Zellen diese unterschiedlichen Signalintensitäten auslesen und wie die ausgelesenen Signale letztendlich dafür sorgen, dass die Stammzellen im Embryo unterschiedliche Differenzierungswege einschlagen. Unsere Studien am Zebrafisch zeigen, dass die Aufteilung des Mesoderms in Rumpf-, Herz- und Kopfstrukturen durch bisher kaum untersuchte Wechselwirkungen zwischen Ntl, FoxH1 und Mixer festgelegt wird. Die Ergebnisse deuten auf einen kombinatorischen transkriptionellen Code bei der Umsetzung der TGF-beta Signale hin. In diesem Projekt sollen im Zebrafish die Zielgene des FoxH1/Ntl/Mixer Netzwerks definiert und ihre Regulation auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Der Zebrafisch bietet sich hierbei als Modell an, da er im Bereich der Wirbeltiere einmalige Möglichkeiten zur Kombination genetischer, molekularbiologischer und Microarray-basierender Analysemethoden bietet.

FoxH1 und Mixer sind konservierte Transkriptionsfaktoren mit zentralen Funktionen bei der frühembryonalen Zellspezifierung in Wirbeltieren. Sie werden über den Nodal/TGFbeta Signalweg reguliert und in genetischen Studien wurden ihnen spezifische Funktionen bei der Bildung von Endoderm (Mixer) und axialem Mesoderm (FoxH1), und synergistische Funktionen bei Herzbildung und Regionalisierung des Gehirns zugewiesen. Wie sie diese Zellschicksale definieren ist jedoch erst in Ansätzen verstanden. In dieser Studie am Model Zebrafisch wurden erstmals genomweit die Zielgene dieser Faktoren in einem sich entwickelnden Embryo beschrieben. Zur Identifizierung der Zielgene wurde ein kombinierter Ansatz aus Transkriptomvergleichen und ChIP-Sequenzierungen durchgeführt. Abgleich dieser Daten mit der genomischen Histon- und RNA-Polymerase-Belegung zeigt vor allem aktivierende Funktionen von FoxH1 und deutet auf kontextabhängige Funktionen von Mixer entweder als Aktivator oder als Repressor hin. In Summe wurden über 600 potentiell direkt durch FoxH1 regulierte Zielgene identifiziert. Neben fast allen bekannten FoxH1 Zielen gehörten dazu auch mehrere Gene mit Funktionen in anderen Signalwegen, unter anderem in den Wnt-, Retinsäure-, FGF- und Chemokine-Signalwegen. Einzelne Enhancer Elemente dieser Gene wurden isoliert und die Regulation in Reporter-Assays verifiziert. Die Ergebnisse weisen FoxH1 neben den bekannten Funktionen bei der Autoregulation des Nodal-Signalweges und der Aktivierung mesendodermaler Transkriptionsfaktoren auch eine zentrale Funktion bei der Vernetzung frühembryonaler Signalwegen zu. Für Mixer wurden in dieser Studie erstmals überhaupt die embryonalen Zielgene beschreiben. Zu den über 400 potentiell direkt durch Mixer regulierten Genen gehören auch 80 Mixer/FoxH1 co-regulierte Gene. Darunter auch die bisher vor allem als FoxH1 Ziele etablierten Gene lhx1a und pitx2, für die die co-aktivierende Funktion durch Mixer sowohl in genetischen als auch in Enhancer Studien bestätigt wurde. Daneben wurden auch mehrere fgf Gene als co-regulierte Gene identifiziert. Die Expression von zwei fgfs war reduziert in foxH1 Mutanten und hochreguliert in mixer Mutanten. In den Mixer Mutanten korreliert die Aktivierung dieser FGFs mit einer frühzeitigen und verstärkten Expression mesodermaler Gene. Da FGF-Signale die Endodermbildung inhibieren, deuten die Ergebnisse auf eine indirekte Funktion dieser Mixer-abhängigen fgf Repression bei der Endodermbildung hin. In Summe liefert diese Studie wichtige neue Hinweise auf die Funktion und Interaktion der Transkriptionsfaktoren FoxH1 und Mixer bei der embryonalen Zellspezifizierung und bei der Vernetzung der frühembryonal-wirkenden Signalwege.