Clp1, eine neue RNA-Kinase für das mRNA 3´ End-Prozessieren

RNA-Interferenz (RNAi) ermöglicht die Analyse von Genfunktionen durch das Einbringen von kurzen, synthetischen interferrierenden RNAs (siRNAs) in die Zelle. In Gegensatz zu jenen siRNA und micro-RNA (miRNA) Duplexe, welche endogen durch die RNAseIII Endonuklease Dicer produziert werden und dadurch 5`- Phosphatgruppen besitzen, weisen synthetische siRNAs eine 5`-Hydroxygruppe auf. Um jedoch in den RNA- Induced Silencing Complex (RISC) eingebaut zu werden und um komplementäre RNAs zu schneiden, muss der "guide"-Strang eines siRNA Duplexes eine 5`-Phosphatgruppe aufweisen. Die Identität der für die Phosphorylierung verantwortlichen enzymatische Aktivität war jedoch bisher unbekannt. Wir haben klassische Chromatographie-Methoden angewendet, mit Hilfe derer wir siRNA-Phosphorylierung während der Fraktionierung von humanen Zellextrakten verfolgt haben. Dies führte dazu, dass wir das humane Clp1 (hClp1) Protein als die siRNA-Kinase identifizieren konnten, ein Protein welches zuvor als Komponente der tRNA-Spleiss- und mRNA 3`-Endprozessiermaschinerie beschrieben wurde. Wir haben weiters hClp1 als jene Kinase-Aktivität aufgedeckt, welche synthetische siRNAs phosphoryliert und diese dadurch für deren Einbau in RISC lizensiert, um komplementäre RNAs zu schneiden. Wir stellten weiters fest, dass hClp1 während des tRNA Spleissens das 5` Ende des 3` Exons phosphoryliert, ein Vorgang der benötigt wird, um beide Exons zu ligieren und eine reife tRNA zu produzieren. Wir beantragen nun, die Rolle von hClp1 im mRNA 3`-Endprozessieren zu untersuchen. Wir werden dessen Funktion im mRNA Schneide- und Polyadenylierungsprozess und in der Transkriptionstermination analysieren, bei der die RNA Polymerase II von der DNA durch einen 5` Phosphatgruppen-abhängigen Exonuklease-Aktivität abgelöst wird. Ein zweites Ziel stammt von der Analyse von hClp1 im tRNA-Spleissen, und ist die Identifizierung der bislang unbekannten tRNA Ligase. Eine Möglichkeit ist, dass die tRNA-Ligase und 2`-3` zyklische Phosphodiesterase (CPD) ein und dasselbe Polypeptid sind, vergleichbar mit der multifunktionellen - Kinase , CPD und Ligase - Hefe tRNA-Ligase. Mittels Bioinformatik haben wir bereits humane CPD Kandidaten identifiziert, welche wir testen werden sowohl bezüglich CPD und tRNA-Ligase Aktivitäten, als auch bezüglich ihrer physiologischen Rolle im tRNA-Spleissen.

Das Ziel dieses Projektantrages war die Analyse der Funktion der RNA-Kinase Clp1 in Bezug auf zellulären RNA- Metabolismus, insbesondere während des tRNA-Spleissens, mRNA 3`-Endschneidens und der Transkriptionstermination. Wir konnten eine neue und unerwartete Rolle des ATP-Bindemotives von Clp1 aufdecken, die es auf die Aktivität der tRNA-Spleissendonuklease TSEN ausübt. Wir konnten zeigen, dass HeLa Zellextrakte, welche zuvor von ATP depletiert wurden, reduziertes pre-tRNA Schneiden durch die TSEN-Spleissendonuklease aufweisen. Immunpräzipitate vom TSEN-Komplex aus ATP-depletierten HeLa Zellextrakten waren weniger fähig tRNA- Exons zu generieren, jedoch waren in der Reaktion effizient, falls nachträglich ATP zugegeben wurde. Ein spezifisches Inhibitormolekül gerichtet gegen Clp1`s RNA-Kinaseaktivität (entwickelt in einer Zusammenarbeit mit Boehringer Ingelheim) oder AMP-PNP, ein ß- nicht-hydrolysierbares ATP-Analog, inhibierten das pre-tRNA Schneiden von semi-gereinigten TSEN-Clp1 Komplexen. Interessanterweise zeigten affinitätsgereinigte TSEN- Komplexe, welche mit Clp1 assoziiert waren, das eine Mutation im ATP-Bindemotiv aufwies, ein ineffizientes pre-tRNA Schneiden. Wir schliessen daraus, dass die ATP-Hydrolyse und/oder die RNA-Kinase Aktivität von Clp1 entscheidend für eine effiziente pre-tRNA Schneidereaktion durch den TSEN-Komplex in-vitro ist (ein Manuskript für eine Publikation ist in der Vorbereitungsphase). Im Gegensatz zu diesen Resultaten spielt Clp1`s Kinaseaktivität keine Rolle während des mRNA 3`-Endschneidens als auch der Transkriptionstermination von RNA Polymerase II in-vitro (in Zusammenarbeit mit Steven West und Nick Proudfoot, Oxford-Universität). Um die endogenen RNA-Substrate für Clp1 zu identifizieren, haben wir versucht, neue RNA-Reinigungs- und Klonierstrategien für das Hochdurchsatz-Sequenzieren zu etablieren, als auch RNA-Kinase-Substratkandidaten zu evaluieren. Wir waren jedoch wegen technischen Schwierigkeiten leider bis jetzt nicht in der Lage, Bedingungen zu etablieren, die uns erlauben, Substrate der RNA-Kinase Clp1 zu identifizieren und verifizieren. Wir konnten erfolgreich Extraktionsmethoden und in-vitro Reaktionsbedingungen optimieren, welche erlauben, Defekte im pre-tRNA-Schneiden zu offenbaren, welche durch Mutationen in der Clp1-assoziierten TSEN54- Untereinheit hervorgerufen sind, die in Patienten mit der neurodegenerativen Krankheit "pontocerebellar hypoplasia" vorkommen (In Zusammenarbeit mit Frank Baas, Academic Medical Center, Amsterdam). Mäuse mit einer Deletion im Clp1-Gen (Knock-out) oder jene, die eine mutierte RNA-Kinase inaktive Clp1- Version kodieren (Knock-in), wurden zusammen mit der Gruppe von Josef Penninger (IMBA) entwickelt. Knock- in Mäuse zeigen einen Motorneuronen-Defekt. Wir haben letztens Fortschritte gemacht, eine Verbindung zwischen der Mutation und dem Defekt zu finden. Ein Manuskript für eine Publikation ist geplant. Wir haben in einem "Spin-Off" aus unserem Erstantrag das Protein Nol9 entdeckt, welche eine humane nukleoläre RNA-Kinase mit grosser Homologie zu Clp1 ist (Heindl and Martinez, 2010) und die essentiell für das ribosomale RNA-Prozessieren ist. Die Rolle von Grc3, das homologe Enzym in S. cerevisiae wurde in einer Kollaboration mit Nick Proudfoot analysiert, und es konnte dessen Relevanz während der RNA Polymerase I Termination gezeigt werden (Braglia et al., 2010.