Rekombination und Verpackung bei Flaviviren

Das Genus Flavivirus umfasst eine Anzahl von durch Stechmücken oder Zecken auf den Menschen übertragbarer Kranheitserreger von weltweiter Bedeutung. Drei dieser Viren werden im hier beschriebenen Projekt untersucht: das Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus, das West Nil Virus, und der Erreger der Japanischen Enzephalitis. Flaviviren besitzen ein einzelsträngiges RNA Genom, das gemeinsam mit dem viralen Kapsidprotein C das Nukleokapsid des Virus bildet. Dieses ist von einer Membranhülle umgeben, in die zwei weitere Virusproteine verankert sind. In diesem Projekt werden zwei fundamentale, molekulare Mechanismen der Vermehrung von Flaviviren angesprochen, nämlich die Verpackung und die Rekombination des RNA Genoms. Obwohl die Verpackung des Virusgenoms in ein Nukleokapsid einen essentiellen Schritt in der Bildung von Viruspartikeln darstellt, ist weitgehend unbekannt wodurch die Effizienz und Spezifität dieses Prozesses gewährleistet wird. Dies wäre aber nicht nur wichtig, um die evolutionären Rahmenbedingungen von Flaviviren besser zu verstehen, sondern könnte auch neue Ansatzpunkte für antivirale Therapien liefern. Viele RNA Viren besitzen eine hohe evolutionäre Flexibilität, die auch durch Rekombinationsereignisse zwischen RNA Molekülen gefördert werden kann. Bei Flaviviren wird die Häufigkeit solcher Ereignisse, deren Rolle und molekulare Grundlagen sehr unterschiedlich eingeschätzt. Obwohl das zunehmende Auftreten mehrerer Flaviviren in manchen Verbreitungsgebieten und die Verwendung vermehrungsfähiger Impfviren es immer wichtiger machen, Rekombinationsereignisse gezielt zu untersuchen, fehlt es bislang völlig an geeigneten Testsystemen für solche Analysen. Verpackung und Rekombination sind beide eng mit dem Prozess der Replikation der viralen RNA verknüpft. Wir haben ein neues Testsystem entwickelt, mit dessen Hilfe beide Mechanismen anhand von zwei gleichzeitig in derselben Wirtszelle replizierenden, nicht infektiösen RNA Molekülen (Replikons), denen unterschiedliche Anteile der genetischen Information für eines der Strukturproteine fehlen, untersucht werden können. Wenn die beiden Replikons gemeinsam in dieselbe Wirtszelle eingebracht werden, sind sie in der Lage eine "infektiöse Allianz" zu bilden, indem sie jeweils den Defekt des anderen Partners ausgleichen. Durch diesen Ansatz ist es erstmals möglich die Grundlagen des Verpackungsprozesses unter quasi natürlichen Bedingungen zu studieren. Gleichzeitig stellt dieser experimentelle Ansatz eine "Rekombinationsfalle" dar, ein feines Instrumentarium um Rekombinationsereignisse aufzuspüren, die zur Bildung infektiöser Viruspartikel führen. Verpackung und Rekombination werden nicht nur für jedes der drei Flaviviren genau untersucht werden, sondern in einem weiteren Schritt werden diese Prozesse auch in heterologen Systemen, also mit RNA Molekülen von unterschiedlichen Viren, analysiert. Der Erforschung heterologer Rekombination kommt angesichts der zunehmenden Häufigkeit von Doppelinfektionen durch verschiedene Flaviviren besondere Bedeutung zu. Die Erkenntnisse aus diesem Projekt werden unser Verständnis der Evolution von Flaviviren vertiefen, aber auch helfen Gesundheitsrisken besser einzuschätzen und neue antivirale Strategien zu entwickeln.

In diesem Projekt haben wir grundlegende Aspekte der Molekularbiologie von Flaviviren erforscht, die auch von praktischer Relevanz sind. Diese Viren werden durch Stechmücken oder Zecken übertragen und beinhalten eine Reihe wichtiger humanpathogener Erreger wie das Gelbfieber Virus, die Dengue Viren, das Japanische Enzephalitis Virus, das West Nil Virus und das Frühsommermeningoenzephalitis Virus. Die erhaltenen Ergebnisse sind für die Entwicklung und Anwendung von Flavivirus Impfstoffen von Bedeutung und können zur Entdeckung von Angriffspunkten für antivirale Medikamente beitragen. Insbesondere haben wir uns mit der Frage beschäftigt, ob es bei gemischten Infektionen mit verschiedenen Flaviviren und/oder Impfung mit Lebendvakzinen zur Entstehung von neuen und potentiell gefährlichen Viren durch den Prozess der RNA Rekombination kommen kann. Dabei vermehren zwei verschiedene, aber miteinander verwandte, Viren ihre genetische Information in ein und derselben Zelle, wodurch die Entstehung von gemischten Genomen und in weiterer Folge von Viren mit unvorhersehbaren biologischen Eigenschaften zumindest theoretisch ermöglicht wird. Um diese wichtige Frage für Flaviviren zu klären, haben wir ein hochsensitives experimentelles System entwickelt eine sogenannte Rekombinationsfalle mit deren Hilfe neu gebildete Viren entdeckt werden können, auch wenn die dafür nötige Rekombination ein sehr seltenes Ereignis darstellt. Unsere Ergebnisse sind beruhigend für die Entwickler von Flavivirus Impfstoffen, weil sie zeigen, dass das Risiko der Entstehung neuer Viren durch Rekombination sehr gering ist und daher kein ernsthaftes Problem für die Impfstoff-Anwendung darstellen dürfte. Damit haben die Ergebnisse dieses Teils unseres Projekts eine kontroversielle Diskussion zwischen Wissenschaftlern, Regulationsbehörden und Impfstoffherstellern aufgelöst, die vor allem im Zusammenhang mit neuen tetravalenten Dengue Lebendimpfstoffen große Bedeutung erlangt hat, weil dabei vier Impfviren gleichzeitig verabreicht werden und sich im Impfling vermehren.In weiteren Teilen unseres Projekts haben wir die Rolle spezifischer Strukturelemente in der viralen RNA bei der Genexpression untersucht und uns auch mit strukturellen und funktionellen Details jener Eiweißmoleküle an der Virusoberfläche auseinandergesetzt, die beim Eindringen in die Zelle eine entscheidende Rolle spielen. In beiden Fällen konnten wichtige Aspekte des viralen Infektionsprozesses aufgeklärt werden, wobei dieses Wissen geeignet ist, neue Angriffspunkte für antivirale Agentien zu finden und damit Möglichkeiten für die Entwicklung antiviraler Medikamente zu eröffnen. Dies trifft insbesondere auf die beim Viruseintritt beteiligten Strukturen zu, weil diese auch zugänglich sind, wenn sich das Virus noch außerhalb der Zelle befindet und eine entsprechende Wirksubstanz daher nicht in die bereits infizierte Zelle eindringen muss.