Knochen Matrix-Osteoblast Rückkoppelungsmechanismus

Kollagen, der Hauptbstandteil aller Bindegewebsarten, einschließlich der extrazellulären Matrix des Knochens, umfasst eine Familie von strukturell verwandten Proteinen, welche eine ähnliche super-molekulare Organisation aufweisen. Die einzelnen Kollagenmolkeüle werden einer Reihe von intra- und extrazellulären Modifikationen unterzogen, die es ihnen ermöglicht extrazellulär Kollagenfibrillen auszubilden. Ein wesentlicher Schritt der Kollagen / Matrix Reifung ist die Ausbildung von Kollagenquervernetzungen. Dieser Prozeß ist gewebespezifisch und wird von vielen zellulären und matrix-abhängigen Signalen gesteuert. Hemmung der Lysyloxidase, ein Schlüsselenzym der Kollagenvernetzung, führt zu veränderten Quervernetzungen und gestörter Fibrillogenese. Ergebnisse aus in-vitro als auch in-vivo durchgeführten Experimenten bestätigten, dass solche Veränderungen zu Knochenmineralverlust, reduzierter Knochenfestigkeit und einer veränderten Mineralisation führen. Aufgrund dieses Wissens vermuten wir, dass die zeitliche und räumliche Abfolge wie die Matrix, im speziellen Kollagen, aufgebaut wird einen Einfluß sowohl auf die Produktionsrate als auch auf die Reifung der Matrix selbst hat. Daher sollte eine Änderung der Matrixeigenschaften Signale erzeugen welche die Aktivität und Funktion der Matrix produzierenden Zellen beeinflussen. Ziel dieses Projektes ist es, Rückkopplungsmechanismen von der Matrix zu den Matrix-produzierenden Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wollen wir zuerst die in vitro produzierte Matrix von osteoblastenähnlichen MC3T3-E1 Zellen charakterisieren, indem wir die Fasereigenschaften der Matrixproteine und die Kollagenquervernetzungen sowie die Expression verschiedener Markerproteine untersuchen. Diese Daten sollen uns Aufschluss über die Eigenschaften der in-vitro produzierten Matrix im Vergleich zu in-vivo synthetisierten Martix geben. Unter Verwendung von "Attenuated Total Refelection FTIR", einer speziellen Methode der Infrarotspektroskopie, planen wir auch die Kinetik der Matrixsynthese in vitro zu studieren. Weiters planen wir die Effekte verschiedener lathyrogener Substanzen, also Inhibitoren der Lysyloxidase, auf die in vitro Produktion der ECM mit den oben beschriebenen Methoden zu untersuchen. Schliesslich wollen wir Osteoblasten auf den unterschiedlichen Matrizen kultivieren und die Expression der wesentlichen Differenzierungsmarkergene bestimmen. Dabei sollten Osteoblasten auf normaler Matrix, verglichen mit Osteoblasten auf lathyritischer Matrix, unterschiedliche Genexpressionsmuster aufweisen. Mittels DNA-Microarray Untesuchungen wollen wir unterschiedlich exprimierte Gene identifizieren und deren Expression genauer untersuchen, um die Mechanismen, die zur Reifung der Knochenmatrix führen, besser zu verstehen.

Kollagen als ein Hauptbestandteil aller Bindegewebsarten einschließlich der extrazellulären Matrix des Knochens umfasst eine Familie von strukturell verwandten Proteinen, die eine ähnliche super-molekulare Organisation aufweisen. Das Grundelement von Kollagen ist die Faser, die einer Reihe von intra- und extrazellulären Modifikationen unterzogen wird, bevor sie in stabilen Fibrillen angeordnet wird. Ein wesentlicher Schritt der Kollagen/Matrix-Reifung ist die Ausbildung von Kollagenquervernetzungen. Dieser Prozess ist gewebespezifisch und wird von vielen zellulären und matrixabhängigen Signalen gesteuert. Die Hemmung der Lysyloxidase (Lox), einem Schlüsselenzym der Kollagenvernetzung, führt zu verminderter Quervernetzung mit veränderter Fibrillenbildung. Ergebnisse aus in-vitro als auch in-vivo Experimenten bestätigten, dass solche Veränderungen in der Matrixbildung zu Knochenmineralverlust, reduzierter Knochenfestigkeit und einer veränderten Mineralisation führen. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse führten wir Experimente durch, die zeigten, dass die zeitliche und räumliche Abfolge, wie Knochenmatrix, vor allem Kollagen, gebildet wird, die Matrixablagerung als auch seine Reifung beeinflusst. Aus diesem Grund löst eine Veränderung in den Matrixeigenschaften Signale aus, die die Funktion und Aktivität von matrixproduzierenden Zellen beeinflussen. Unsere Experimente zeigten weiters, dass knochenbildende Zellen (Osteoblasten), die auf einer veränderten Matrix kultiviert werden, ihr Verhalten bereits auf Ebene der Boten-RNA-Bildung, dem ersten Schritt in der Proteinbiosynthese, ändern. Darüber hinaus hat die Art und Weise, wie die ursprüngliche Matrix gestört ist, direkten Einfluss auf das Verhalten der Zellen. Eine spezielle Art der Infrarot-Spektroskopie, und zwar die ATR (abgeschwächte Totalreflexions)-Methode wurde angewendet, um die Bildung von extrazellulärer Matrix quantitativ und qualitativ zu verfolgen. Die Verwendung einer speziell konstruierten Durchflusskammer ermöglichte die Überwachung dieses Vorgangs in Echtzeit unter dynamischen Bedingungen, die der in-vivo-Situation besser gerecht werden als die statischen Verhältnisse in Zellkulturen. Die Verwendung von Homocystein (Hcys) im Kulturmedium ist ein Weg, um eine geänderte Matrix herzustellen. Da erst kürzlich Hcys mit einem erhöhten Knochenbruchrisiko bei Menschen in Verbindung gebracht wurde, fokussierten wir unsere Arbeit auf seine Auswirkungen auf pre-osteoblastäre MC3T3-E1-Zellen. Interessanterweise zeigten die durchgeführten Experimente den umfangreichen Einfluss von Hcys auf die zelluläre Bildung von Boten-RNA. Zusätzlich zu den Genen, die im allgemeinen mit der Funktion von Osteoblasten in Verbindung gebracht werden, wie z.B. runt related transcription factor 2 (Runx2) und Lox, wurden auch Gene wie Interleukin 6 (IL-6), DNA methyl-transferasen (Dnmt`s) und Serum Amyloid A3 (Saa3) durch Hcys reguliert, was einen ersten Eindruck auf zugrundeliegende Mechanismen für zahlreiche Krankheiten des Stoffwechsels und des Stütz- und Bewegungsapparats ermöglicht. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass Hcys die Proliferation, Differenzierung und Funktion von Osteoblasten auf verschiedenen Stufen beeinflusst. Aus diesem Grund ist Hcys ein Hauptrisikofaktor für die Entstehung der Knochenbruchkrankheit (Osteoporose).