EWS/EWS-FLI1 in post-transkriptioneller Gen-Regulation

TET (TLS, EWS, TAF15) Gene kodieren für eine evolutionär konservierte Familie von RNA bindenden Proteinen. In Sarkomen und akuten Leukämien sind diese Gene durch chromosomale Umlagerungen häufig mit Transkriptionsfaktorgenen rearrangiert. TET Proteine spielen in der RNA Prozessierung eine Rolle, aber TET- Fusionsproteine werden als gestörte Transkriptionsfaktoren angesehen. Das erste Mitglied der TET Proteine war EWS, welches in Tumoren der Ewing Sarkom Familie in Folge der chromosomalen Translokation t(11;22)(q24;q12) an den Transkriptionsfaktor FLI1 fusioniert wird. Bisher konzentrierte sich die Forschung auf die Identifikation von Zielgenen und deren transkriptionelle Regulation. EWS-FLI1 könnte aber direkt oder durch Beeinträchtigung der normalen EWS Funktion den post-transkriptionellen RNA Metabolismus beeinflussen. Da heute veränderter RNA Prozessierung eine hohe Bedeutung in der Tumorgenese zugemessen wird, schlagen wir vor, die Rolle von EWS und EWS-FLI1 für die Prozessierung von Protein-kodierenden und MicroRNAs zu untersuchen. Mehrere experimentelle Befunde unterstützen die Annahme einer Funktion von EWS-FLI1 im post- transkriptionellen RNA Metabolismus: i) Die minimal transformierenden Domänen von EWS-FLI1 überlappen nur teilweise mit den transkriptionell wichtigen Domänen; ii) EWS und EWS-FLI1 assoziieren nicht nur mit Komponenten der RNA Polymerase II sondern auch mit einer Reihe von RNA-Prozessierungsfaktoren; iii) EWS und EWS-FLI1 können physisch miteinander interagieren; iv) Es besteht Evidenz, dass EWS-FLI1 mit EWS-vermitteltem RNA Splicing interferiert; v) EWS assoziiert mit der RNase III DROSHA, welche für den ersten Schritt der MikroRNA- Vorläuferprozessierung verantwortlich ist; Deshalb vermuten wir, dass EWS-FLI1 eine Schlüsselrolle für post-transkriptionelle Veränderungen des Splicings und der MicroRNA Prozessierung spielen könnte. Die in diesem Projekt vorgeschlagenen experimentellen Strategien stützen sich auf in unserem Labor bereits etablierte Zelllinienmodelle. Durch gezielte Mutationen von EWS und EWS-FLI1 und Expression in einem einzigartigen EWS-negativen Zelllinienmodell wird eine umfassende Struktur-Funktionsanalyse möglich. So soll der gegenseitige Einfluss der RNA- und DNA- Bindungsaktivität dieser beiden Proteine auf die mRNA und die MicroRNA Expression untersucht werden. Genom-weite mRNA und MicroRNA Expressionsanalysen kombiniert mit Verfahren zum Nachweis von alternativer RNA Prozessierung auf der Basis von Exon-Arrays werden als Messmethoden eingesetzt. Die an den Zelllinienmodellen gewonnenen Ergebnisse werden in primärer Tumoren validiert werden. Zusätzlich werden wir den Einfluss von EWS und EWS-FLI1 auf das alternative Splicen von in unserem Labor identifizierten EWS-FLI1 Zielgenen mit intronischen Bindungsstellen untersuchen. Zuletzt wollen wir versuchen, RNA Moleküle, welche in ESFT mit EWS assoziiert vorliegen, zu isolieren und ihre Beziehung zu differentiell exprimierten mRNA Isoformen und Micro RNAs zu definieren. In diesem Projekt dient das EWS/EWS-FLI1 System als Paradigma für das Studium von RNA-abhängigen Mechanismen der Tumorgenese, was schließlich zur Identifikation neuer therapeutischer Angriffspunkte führen soll.

TET (TLS, EWS, TAF15) Gene kodieren für eine evolutionär konservierte Familie von RNA bindenden Proteinen. In Sarkomen und akuten Leukämien sind diese Gene durch chromosomale Umlagerungen häufig mit Transkriptionsfaktorgenen rearrangiert. TET Proteine spielen in der RNA Prozessierung eine Rolle, aber TET- Fusionsproteine werden als gestörte Transkriptionsfaktoren angesehen. Das erste Mitglied der TET Proteine war EWS, welches in Tumoren der Ewing Sarkom Familie in Folge der chromosomalen Translokation t(11;22)(q24;q12) an den Transkriptionsfaktor FLI1 fusioniert wird. Bisher konzentrierte sich die Forschung auf die Identifikation von Zielgenen und deren transkriptionelle Regulation. EWS-FLI1 könnte aber direkt oder durch Beeinträchtigung der normalen EWS Funktion den post-transkriptionellen RNA Metabolismus beeinflussen. Da heute veränderter RNA Prozessierung eine hohe Bedeutung in der Tumorgenese zugemessen wird, schlagen wir vor, die Rolle von EWS und EWS-FLI1 für die Prozessierung von Protein-kodierenden und MicroRNAs zu untersuchen. Mehrere experimentelle Befunde unterstützen die Annahme einer Funktion von EWS-FLI1 im post- transkriptionellen RNA Metabolismus: 1. Die minimal transformierenden Domänen von EWS-FLI1 überlappen nur teilweise mit den transkriptionell wichtigen Domänen; 2. EWS und EWS-FLI1 assoziieren nicht nur mit Komponenten der RNA Polymerase II sondern auch mit einer Reihe von RNA-Prozessierungsfaktoren; 3. EWS und EWS-FLI1 können physisch miteinander interagieren; 4. Es besteht Evidenz, dass EWS-FLI1 mit EWS-vermitteltem RNA Splicing interferiert; 5. EWS assoziiert mit der RNase III DROSHA, welche für den ersten Schritt der MikroRNA- Vorläuferprozessierung verantwortlich ist. Deshalb vermuten wir, dass EWS-FLI1 eine Schlüsselrolle für post-transkriptionelle Veränderungen des Splicings und der MicroRNA Prozessierung spielen könnte. Die in diesem Projekt vorgeschlagenen experimentellen Strategien stützen sich auf in unserem Labor bereits etablierte Zelllinienmodelle. Durch gezielte Mutationen von EWS und EWS-FLI1 und Expression in einem einzigartigen EWS-negativen Zelllinienmodell wird eine umfassende Struktur-Funktionsanalyse möglich. So soll der gegenseitige Einfluss der RNA- und DNA- Bindungsaktivität dieser beiden Proteine auf die mRNA und die MicroRNA Expression untersucht werden. Genom-weite mRNA und MicroRNA Expressionsanalysen kombiniert mit Verfahren zum Nachweis von alternativer RNA Prozessierung auf der Basis von Exon-Arrays werden als Messmethoden eingesetzt. Die an den Zelllinienmodellen gewonnenen Ergebnisse werden in primärer Tumoren validiert werden. Zusätzlich werden wir den Einfluss von EWS und EWS-FLI1 auf das alternative Splicen von in unserem Labor identifizierten EWS-FLI1 Zielgenen mit intronischen Bindungsstellen untersuchen. Zuletzt wollen wir versuchen, RNA Moleküle, welche in ESFT mit EWS assoziiert vorliegen, zu isolieren und ihre Beziehung zu differentiell exprimierten mRNA Isoformen und Micro RNAs zu definieren. In diesem Projekt dient das EWS/EWS-FLI1 System als Paradigma für das Studium von RNA-abhängigen Mechanismen der Tumorgenese, was schließlich zur Identifikation neuer therapeutischer Angriffspunkte führen soll.