Die Bedeutung des TRAP Enzyms bei der Knochenbildung

Große Teile unseres Skeletts entstehen aus knorpeligen Anlagen, wobei die langen Knochen (z.B.: Femur, Tibia) durch perichondrale und enchondrale Knochenbildung gebildet werden. Die perichondrale Knochenmanschette entwickelt sich außen an der knorpeligen Anlage während die enchondrale Knochenbildung im inneren der Anlage stattfindet. Dabei werden zunächst das primäre (PKZ) und folgend das sekundäre Knochenzentrum (SKZ) gebildet. Dies führt zur Etablierung der Wachstumszone, eine wesentliche Struktur für das Längenwachstum. Wesentlich für die Bildung des SKZ ist das Einwachsen von vaskularisierten Kanälen in die Epiphyse (lvarez et al. 2005A; Holmbeck and Szabova 2006; Blumer et al. 2007). Dieser Vorgang erfordert proteolytische Enzyme, welche die Knorpelmatrix auflösen, um so den Eintritt von Gefäßen zu ermöglichen (Holmbeck et al. 1999, 2003; Zhou et al. 2000; Lee et al. 2001; Davoli et al. 2001; lvarez et al. 2005A; Holmbeck and Szabova 2006). Um die Bedeutung dieser Enzyme zu zeigen wurden "Knockout" Mäuse untersucht. In jenen Mäusen wo zum Beispiel das Enzym membrane-bound type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP = MMP 14) fehlt, wandern keine Knorpelkanäle mit Gefäßen ein und die Bildung des SKZ unterbleibt. Die betreffenden Mäuse zeigen eine fehl gebildete Wachstumszone mit reduziertem Längenwachstum (Holmbeck et al. 1999; Zhou et al. 2000). In den tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) "Knockout" (-/-) Mäusen sind die langen Knochen ebenfalls kürzer als normal und dies resultiert vermutlich durch eine abweichende Knochenbildung in der Epiphyse und einer fehl strukturierten Wachstumszone (Hayman et al. 1996, 2000; Hollberg et al. 2002; Hayman and Cox 2003; Roberts et al. 2007). In den TRAP -/- Mäusen verknöchert zwar die Epiphyse (Hollberg et al. 2002), aber es ist unklar ob dies via den Knorpelkanälen geschieht oder durch einen alternativen Mechanismus. Um die individuelle Bedeutung des TRAP Enzyms und seiner Interaktion mit anderen proteolytischen Enzymen und Knochen-relevanten Proteinen zu verstehen, wollen wir nun TRAP -/- Mäuse untersuchen. Bezüglich der Knochenbildung in der Epiphyse scheinen zwei Szenarien möglich: (1) Knorpelkanäle sind in den TRAP -/- Mäusen vorhanden: wenn das so ist, dann ist es sehr wahrscheinlich, dass jene Vorgänge, die zu der Bildung der Kanäle und des SKZ führen, signifikant verändert sind. Deshalb möchten wir zunächst jene Zellen und Proteine analysieren, die für die Bildung der Kanäle entscheidend sind. Weiters, wollen wir den Zeitpunkt und die Lokalisation von Knochen-relevanten Proteinen untersuchen. (2) Knorpelkanäle sind in den TRAP -/- Mäusen nicht vorhanden: wenn das so ist, dann erfolgt die Verknöcherung der Epiphyse durch einen anderen Mechanismus, der im Detail untersucht werden soll. Wir planen in dieser Studie das Femur einer Entwicklungsreihe von postnatalen Mäusen zu untersuchen und beabsichtigen die Ergebnisse der TRAP -/- Maus mit jenen des Wildtyps und der heterozygoten TRAP +/- Maus zu vergleichen. Wir werden mit zwei internationalen Forschungsgruppen kooperieren, wobei die eine davon die "Knockout" Mäuse zu Verfügung stellt. Für unsere Untersuchungen benötigen wir eine finanzielle Unterstützung von 266.903,7.

Das menschliche Skelett besteht aus Knochen, die sich Großteils aus knorpeligen Anlagen (ausgenommen ist der Schädel) entwickeln. Auf Grund ihrer äußeren Form werden die Knochen in lange, kurze, flache und unregelmäßig-geformte Knochen unterteilt. Lange Knochen (z.B.: Ober- bzw. Unterschenkelknochen) entstehen durch perichondrale und enchondrale Knochenbildung. Die perichondrale Knochenmanschette entwickelt sich außen an der knorpeligen Anlage während die enchondrale Knochenbildung im Inneren stattfindet. Dabei werden zunächst das primäre Knochenzentrum im Knochenschaft (Diaphyse) und dann erst das sekundäre Knochenzentrum in den Knochenenden (Epiphysen) gebildet. Zwischen diesen beiden Zentren bleibt eine knorpelige Wachstumszone erhalten, die wesentlich für das Längenwachstum der Knochen ist. Nach dem Abschluss des Längenwachstums ist das Knorpelgewebe vollständig durch Knochengewebe ersetzt, nur an den Enden der Knochen bleibt der Gelenksknorpel bestehen. Für die enchondrale Knochenbildung ist das Einwachsen von Blutgefäßen zusammen mit den knochenbildenden Zellen von zentraler Bedeutung. Damit diese Prozesse störungsfrei ablaufen können, muss zunächst das Knorpelgewebe durch verschiede Enzyme aufgelöst werden. Mehrere Arbeiten an Mäusen haben gezeigt, dass das Ausknocken bestimmter Enzyme das Einwachsen der Blutgefäße in die Knochenenden verzögert oder sogar verhindert. Dadurch wird die Bildung des sekundären Knochenzentrums gestört, die Wachstumszone histologisch verändert und ihre Funktion beeinträchtigt. Die knock out Mäuse haben folglich kürzere Ober- und Unterschenkelknochen. In tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) knock out Mäusen sind Ober- und Unterschenkelknochen ebenfalls verkürzt und die Wachstumszone ist fehlstrukturiert. Es wurde vermutet, dass TRAP entscheidend für die Auflösung des Knorpels ist und ein Fehlen des Enzyms die Einwanderung der Gefäße in die Epiphyse und die Bildung des sekundären Knochenzentrums verzögert. Die Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass TRAP die Gefäßeinwanderung nicht beeinflusst. In den TRAP knock out Mäusen erfolgt zwar eine frühzeitige Bildung von Knochen, aber die Ergebnisse über eine längerer Entwicklungsphase (3 Monate nach der Geburt) zeigen, dass die Bildung des sekundären Knochenzentrums nicht beeinträchtigt ist. Histologische Veränderungen in Form einer starken Ausdehnung der Wachstumszone treten erstmals 3 Wochen nach der Geburt auf und sind auch noch bei adulten Mäusen (3 Monate) erkennbar. Eine erhöhte Knochendichte (Osteopetrose) ist nur im primären Knochenzentrum feststellbar. Zusammengefasst, TRAP knock out Mäuse haben kürzere Knochen im Vergleich zum Wild-Typ, TRAP ist aber nicht entscheidend für die Gefäßeinwanderung und Bildung des sekundären Knochenzentrums in den Epiphysen langer Knochen.