Drosophila FAS II- & ß-Oxidation-Enzyme

Einige genetisch bedingte Krankheiten, wie z.B. Zellweger Syndrom oder Adrenoleuko-dystrophie, sind auf den Mangel an funktionellen Peroxisomen zurückzuführen, wodurch Störungen der neuronalen Entwicklung und Neurodegeneration entstehen. In gesunden Zellen enthalten die Peroxisomen neben den Enzymen des Wasserstoffperoxid-Metabolismus eine Reihe anderer Proteine, die an wichtigen metabolischen Prozessen beteiligt sind. Dazu gehört u.a. auch der Abbau von Fettsäuren, welcher in allen Organismen in den Peroxisomen stattfindet, aber zumindest in Säugetieren zusätzlich auch in den Mitochondrien abläuft. Ein Modellsystem für neuronale Entwicklung stellt die Fruchtfliege Drosophila melanogaster dar, deren Nervenzellen morphologisch gut charakterisiert sind, und deren komplettes Genom bereits sequenziert ist. Allerdings ist sehr wenig über die Peroxisomen und Mitochondrien oder über den Abbau sowie die Synthese von Fettsäuren in diesem Organismus bekannt. Um herauszufinden, ob D. melanogaster ein gutes System für Untersuchungen über den Einfluß des Fettsäuremetabolismus auf die neuronale Entwicklung ist, sollten in einem ersten Schritt die in den Organellen dieses Organismus enthaltenen Fettsäuremetabolismus-Proteine charakterisiert werden. Im Rahmen des vorliegenden Projekts sollen daher offene Leserahmen aus D. melanogaster kloniert werden, deren Produkte an der ß-Oxidation oder Synthese von Fettsäuren beteiligt sind; die entsprechenden Proteine in Bakterien produziert und ihre enzymatische Ativität identifiziert werden; die intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden Proteine als Fusionsproteine in der Hefe Saccharomyces cerevisiae bestimmt werden; entsprechende Hefemutanten mit den cDNAs für diese neuen Proteinen komplementiert werden. die Folgen vom Gene-Knockdown Drosophila eingeschätzt werden für Gene, die mit Hilfe der Komplementationsexperimente in Hefemutanten als kodierend für physiologisch FASII und ß-Oxydation Enzyme identifiziert wurden.

In Eukaryoten sind sowohl Fettsäure-Abbau (ß-Oxidation), als auch Typ-II-Fettsäure-Biosynthese (FAS II) kompartimentalisiert. Die an diesen Prozessen beteiligten Gene und Enzyme, wurden bereits alle für Saccharomyces cerevisiae über Mutanten identifiziert. In diesen Organismen ist die ß-Oxidation ausschließlich peroxisomal lokalisiert, während die FAS II nur in den Mitochondrien stattfindet. Im Gegensatz dazu ist die räumliche Trennung dieser Stoffwechselwege in höher entwickelten Eukaryonten etwas weniger ausgeprägt. Im Gegensatz zu Hefezellen, enthalten tierische Mitochondrien sowohl die Enzyme für den Fettsäure-Abbau, als auch jene für die Biosynthese. Zu Beginn dieses Projektes gab es keinerlei Veröffentlichungen über potentielle Auswirkungen von Mutationen mitochondrialer FAS-II Enzyme in mehrzelligen Organismen. Dies veranlasste uns dazu nach den Genen des kompartimentalisierten Fettsäure-Stoffwechsel in Drosophila melanogaster zu suchen, um mögliche Auswirkungen von Mutationen und damit einem dysfunktionalen Fettsäure-Stoffwechsel zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde das Genom der Fruchtfliege nach offenen Leserahmen gescannt, die eine Ähnlichkeit zu bekannten Genen der ß-Oxidation oder der FAS-II-Typ Fettsäure-Synthese der Hefe aufweisen mit einem Schwerpunkt auf FAS-II. Dies ergab eine Reihe von Kandidatengenen der Fruchtfliege mit signifikanter Homologie zu den entsprechenden Hefe-Genen. Mehrere Drosophila-Enzyme wurden in Mitochondrien von Hefe- Mutanten exprimiert, in denen die jeweilige Enzym-Aktivität fehlte, und aus diesen wurden vier Gene identifiziert, die die fehlenden Hefe Aktivitäten funktionell ersetzen konnten. Enzymaktivitätsmessungen der transformierten Hefezellen bestätigte die Identität der neu identifizierten Drosophila-Proteine. In Zusammenarbeit mit zwei auf Drosophila spezialisierten Labors wurden Mutanten erzeugt, die so konzipiert waren, dass sie in einem von mehreren Enzymen der FAS-II-Biosynthese oder der ß-Oxidation dysfunktional waren, aber diese Mutanten zeigten keine spezifischen Phänotypen. Daher wurden die Untersuchungen der Folgen eines gestörten FAS-II Metabolismus auf einen anderen Vielzeller ausgedehnt, dem Fadenwurm (Nematoden) Caenorhabitis elegans. Das Genom von C. elegans wurde in ähnlicher Weise auf Gene gescannt, die FAS-II-Enzyme kodieren könnten, und das ergab zwei solcher Gene, W09H1.5 und F09E10.3. Eines davon (W09H1.5) wurde in einem Kooperationslabor funktionell ausgeschaltet mit dem interessanten und neuen Ergebnis, dass bei Nematoden FAS-II mit Langlebigkeit verbunden ist. Darüber hinaus wurden neue Gene, die für Fettsäure-Biosynthese-Enzyme kodieren, in einer Reihe von Krankheitserregern untersucht, wie z.B. Mycobacterium tuberculosis und Leishmania major. Dies zeigte, dass das Enzym MtFabG4 als 3-oxoacyl-Thioester-Reduktase wirkt sowie die Fähigkeit des MtFabD das entsprechende Protein in Hefe zu ersetzen. Außerdem konnten die Proteine LmjF07.0430, LmjF07.0440 und LmjF27.2440 die korrespondierenden Hefe-Mitochondrien-Enzyme ersetzen.