Rolle von LRP1b bei Krebs und Atherosklerose

Low-density lipoprotein (LDL) receptor-related protein 1b (LRP1b) ist ein kürzlich entdecktes Mitglied der LDL Rezeptor Familie, die Rezeptoren ähnlicher Struktur mit multiplen Funktionen wie die Aufnahme von Liganden und die Weitergabe intrazellulärer Signale umfasst. Das LRP1b Gen ist in mehreren humanen Tumoren inaktiviert, LRP1b wird daher als potentieller Tumorsuppressor angesehen. LRP1b ist ein sehr großes (600 kDa) Transmembranprotein mit einer limitierten Expression bei der Maus (Gehirn, Hoden, Nebenniere) und beim Menschen (Gehirn, Schilddrüse, Skeletmuskel). In bisherigen Untersuchungen, inklusive der Generierung von LRP1b Knockout Mäusen und der Identifizierung von intrazellulären und extrazellulären Liganden, konnte dem Rezeptor keine spezifische Funktion zugeordnet werden. Der vorliegende Forschungsantrag beinhaltet vier Strategien zur Vertiefung unseres Verständnisses von LRP1b. Die Analyse des Rezeptors wird durch das Fehlen von Zelllinien, welche ausreichende Mengen von LRP1b exprimieren, behindert. Daher soll zunächst ein rekombinanter vollständiger LRP1b Rezeptor konstruiert und in immortalisierten humanen Zellen exprimiert werden. Das Proliferations- und Migrationsverhalten stabil transfizierter Zellen soll im Vergleich zu mock transfizierten Zellen untersucht werden. Alternativ kann eine kürzlich identifizierte Zelllinie (OVCAR-3) mit hoher endogener LRP1b Expression verwendet werden. Mittels FLAG-markierter LRP1b Konstrukte sollen zusätzlich transmembrane und intrazelluläre Bindungspartner identifiziert werden. Als zweiter Ansatz sollen neue zirkulierende Liganden aus dem Plasma mittels Affinitätschromatographie an immobilisierten LRP1b Ektodomänen gereinigt werden. Die Bindung soll mittels Immunpräzipitation verifiziert und die Affinität der Interaktionen bestimmt werden. Die meisten bisherigen Untersuchungen über die Inaktivierung von LRP1b wurden an Tumorzellinien durchgeführt. Um Zellkulturartefakte auszuschließen, sollen Tumorzellen von Patienten mit malignen Pleuraergüssen und malignem Aszites direkt auf Inaktivierung von LRP1b mittels RT-PCR, PCR von somatischer DNA und Western Blot untersucht werden. Alterationen des LRP1b Gens sollen mit klinischen Daten und anderen Tumormarkern korreliert werden. Vor kurzem wurde gezeigt, dass LRP1b wie andere Mitglieder der LDL Rezeptor Familie in glatten Muskelzellen der Arterienwand exprimiert ist, wo der Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Atherosklerose durch die Beeinflussung der Proliferation glatter Muskelzellen analog zu der postulierten Funktion bei der Tumorentstehung spielen könnte. Die Expression von LRP1b in den Zellen der Arterienwand (Endothel, glatte Muskelzellen, Makrophagen) soll quantitativ gemessen werden. Daneben soll die Bindung von Lipoproteinen (LDL, beta-VLDL, HDL) an LRP1b und der Effekt der Liganden auf die Proliferation und Migration dieser Zellen bestimmt werden. Von diesen Versuchen ist eine wesentliche Erweiterung unseres Verständnisses der physiologischen Funktion und der Rolle von LRP1b bei Krebs und Atherosklerose zu erwarten.

Atherosklerose und Krebs liegen in der Liste der Todesursachen weltweit unangefochten an erster Stelle. Das Ziel dieses Forschungsprojektes war die Erforschung der Rolle von LRP1b, eines an der Oberfläche von Zellen vorkommenden Eiweißstoffes, bei diesen beiden folgenschweren Erkrankungen. LRP1b ist Mitglied einer Proteinfamilie (LDL Rezeptorfamilie) mit wichtigen Funktionen in der Entstehung atherosklerotischer Wandveränderungen und war ursprünglich bei der Untersuchung von Lungenkarzinomzellinien entdeckt worden. Dabei zeigte sich, dass diese Zellinien häufig inaktive Formen von LRP1b aufweisen, weshalb LRP1b als potentieller Tumorsuppressor angesehen wurde. Um die spezifische Funktion von LRP1b in einem Zellkulturmodell erforschen zu können, sollte zunächst die für LRP1b kodierende Erbsubstanz (cDNA) isoliert, in einen Vektor verpackt und in humane Zellen eingeschleust werden. Die Hauptschwierigkeit stellte dabei die enorme Größe des Rezeptors dar. LRP1b zählt mit einer Größe von 4600 Aminosäuren, kodiert durch 13800 Nukleotide, zu den größten aus einer einzigen Polypeptidkette bestehenden Proteinen. Trotzdem ist es gelungen, dieses Konstrukt fehlerfrei herzustellen und erfolgreich in humane Zellen einzuschleusen. Erste Ergebnisse dieser Experimente zeigten einen das zelluläre Wachstum hemmenden Einfluss von LRP1b, was mit der oben erwähnten Suppressorfunktion für Tumoren im Einklang steht. Das zweite Ziel des Projektes war die Identifizierung löslicher Bindungspartner des Rezeptors aus humanem Plasma, welche mit Fragmenten des extrazellulären Anteils von LRP1b durchgeführt wurden. Dabei wurde neben Clusterin, einem auf HDL Lipoproteinen gefundenen Protein, auch das für die Blutgerinnung wichtige Fibrinogen als Bindungspartner für LRP1b identifiziert. Im dritten Teil der Experimente sollte LRP1b mittels eines empfindlichen Testverfahrens in Tumorzellen nachgewiesen werden. Dazu wurden Sonden verwendet, welche die Anwesenheit der für den Bau des Rezeptors notwendigen Boten-RNA (mRNA) in der Zelle spezifisch anzeigen und hochempfindlich messen können. Mittels dieser Methode konnten Tumorzellinien mit hoher, niedriger und fehlender LRP1b Expression identifiziert werden. Zuletzt wurde die Bindung von LRP1b an verschiedenen Lipoproteine untersucht. Diese Experimente wurden wieder mit Fragmenten des extrazellulären Anteils von LRP1b durchgeführt und zeigten eine Bindung von VLDL und HDL Lipoproteinen an den Rezeptor. Zusätzlich konnte auch die Aufnahme von VLDL in LRP1b tragende Zellen nachgewiesen werden. Ein weiteres wichtiges Ergebnis der Forschungsarbeit war die Analyse der Gewebsverteilung von LRP1b, welche eine auf wenige Gewebe beschränkte Expression (Gehirn, Schilddrüse, Skelettmuskel, Hoden) ergab. Zusammengefasst wurden durch die im Rahmen des Forschungsprojektes durchgeführten Arbeiten zahlreiche, für unser Verständnis der Rolle von LRP1b bei Krebs und Atherosklerose wichtige Erkenntnisse gewonnen, die in Zukunft auch für die Diagnose und Therapie dieser Erkrankungen eingesetzt werden könnten.