Leitfähigkeit des SecY Proteintranslokationskanals

Viele Proteine müssen nach ihrer Biosynthese durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums oder durch die bakterielle Plasmamembran transportiert werden. Der entsprechende Transportkanal wird in Eukaryonten vom Sec61p-Komplex und in Bakterien und Archea vom SecY-Komplex gebildet. Er erlaubt hydrophilen Polypeptidsegmenten, die Lipiddoppelschicht zu überwinden und hydrophoben Segmenten, die Kanalwand zu passieren, um in die Lipidphase einzutreten. In Bakterien interagiert der SecY-Kanal während des kotranslationalen Proteintransports mit Ribosomen und während der posttranslationalen Translokation mit der zytosolischen ATPase SecA. Unsere bisherigen Experimente haben gezeigt, dass der Kanal im Ruhezustand eine Barriere für die Membranpassage kleiner Moleküle darstellt. Die Barriere wird von einer kurzen Helix, dem so genannten Korken, in der Mitte der Pore gebildet (Saparov et al., 2007. Mol. Cell 26: 501-509). Er befindet sich in unmittelbarer Nachbarschaft zum Porring, einer Einengung in der Mitte der Membran. Die Öffnung des Kanals ist nur dann möglich, wenn sich der Korken aus dem Transportweg herausbewegt. Im Rahmen des jetzt beantragten Vorhabens werden wir untersuchen, wie der aktivierte Kanal d.h. die eine Polypeptidkette translozierende Pore, die Transportbarriere für kleine Moleküle aufrechterhält. Wir werden den gereinigten Translokationskanal in ebene Lipidmembranen einbauen und die ebenfalls gereinigten Bindungspartner allein bzw. mit gebundenen Translokationsintermediaten zugeben. Leitfähigkeit und Öffnungsdauer des Kanals werden mittels elektrophysiologischer Messungen bestimmt. Zusätzlich ist der Einsatz der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie geplant, um die Konzentration der freien und an Ribosomen oder SecA gebunden Translokationskanäle zu bestimmen. Diese Experimente werden zeigen, ob die Bindungspartner allein in der Lage sind, die Öffnungswahrscheinlichkeit des Translokationskanals zu erhöhen und ob die translozierende Kette kleine Moleküle am Durchtritt durch den Kanal hindert. Damit gibt unser Vorhaben Einblick in den Mechanismus, der großen Molekülen erlaubt, den Kanal zu passieren, während kleine daran gehindert werden.

Viele Proteine müssen über die Membran des endoplasmatischen Retikulums oder durch die bakterielle Plasmamembran während oder nach ihrer Synthese transportiert werden. Der Transportkanal, gebildet vom Sec61 Komplex in Eukaryoten und vom SecYEG Komplex in Bakterien bzw. Archea, ermöglicht sekretorischen Proteinen die Passage durch die Lipiddoppelschicht. Er lässt auch Membranproteine durch die Kanalwandung in das Innere der Membran passieren. Während die ribosomale Membranproteinsynthese voranschreitet muss die naszierende Kette unmittelbar in den Kanal gelenkt werden, da die Exposition in einem wässrigen Medium anderenfalls zur Proteinaggregation führt. Das zur Kanalöffnung erforderliche Signal war bisher unbekannt. Wir haben jetzt gezeigt, dass die Ribosomenbindung diese Rolle übernimmt. Der gereinigte und rekonstituierte SecYEG Kanal öffnet mit nahezu einhundertprozentiger Wahrscheinlichkeit wenn Ribosomen binden. Um diese Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, haben wir einen auf der Kombination von Einzelmolekülfluoreszenz und elektrischen Einzelkanalmessungen beruhenden neuen Assay entwickelt. Während des Transports großer Proteine durch die Membran muss der SecYEG Komplex kleine Ionen vom Transport ausschließen. Anderenfalls würde der SecYEG Kanal die Salzlösungen zu beiden Seiten der Membran kurzschließen und wie eine Batterie, deren Pole überbrückt sind, würde die bakterielle Zelle ihre Energie verlieren. Wir konnten jetzt zeigen, dass der Kanal nicht, wie bisher fälschlich angenommen, positive Ionen vom Transport ausschließen kann. Stattdessen schließt er den Transportweg für Ionen in Antwort auf die Transmembranspannung sobald ein Translokationsintermediat installiert ist. Der Einbau vieler Membranporteine erfordert die Interaktion zwischen SecYEG und einer sogenannten Membraninsertase, YidC. Unsere elektrophysiologischen Studien (in Zusammenarbeit mit H.G. Koch, Freiburg) haben gezeigt, dass YidC den Kanaldurchmesser von SecYEG reduziert, wahrscheinlich indem es in das laterale Tor von SecYEG eindringt, d.h. sich im Ausgang für Membranproteine positioniert. Damit haben wir einen ersten mechanistischen Einblick in den, die richtige Proteinfaltung gewährleistenden Mechanismus des Transfers der naszierenden Kette von einem zum anderen Protein gewonnen. Wir haben außerdem den Mechanismus untersucht, der das laterale Tor öffnet. In Zusammenarbeit mit N. Bondar (Berlin) und S. White (Irvine) haben wir ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen identifiziert, das durch die Mutation einer einzigen Aminosäure zerstört werden kann. Im Ergebnis öffnet das Tor spontan und die Barriere für den Ionentransport bricht zusammen. Ermuntert durch den Durchbruch im Verständnis der SecYEG YidC Interaction, haben wir auch die Funktionsweise der gereinigten und separat rekonstituierten YidC Insertase studiert (in Zusammenarbeit mit H.G. Koch, Freiburg). Zu unserer großen Überraschung fanden wir, dass auch die YidC Insertase einen Membrankanal besitzt, der, ganz ähnlich dem SecYEG Kanal, durch Ribosomenbindung geöffnet wird. Auf diese Weise kann YidC den Transport der naszierenden Kette in das Membraninnere während der Synthese gewährleisten. Fußend auf der Messung der Einzelkanalleitfähigkeit können wir schlussfolgern, dass der YidC Kanal im Durchmesser kleiner als der SecYEG Kanal ist.