Picornaviralen Proteasen 2A und Lb: Molekulare Mechanismen

Die Familie der Picornaviren umfasst einige wichtige Mensch- und Tierpathogene wie Poliovirus (PV), humanes Rhinovirus (HRV), Coxsackievirus (CV) und Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV). Impfstoffe wurden bisher erfolgreich gegen PV und MKSV eingesetzt, gegen HRVs und CVs wurden aber bisher keine entwickelt. Zusätzlich sind die MKSV Impfstoffe nur unter bestimmten Bedienungen einsetzbar und PV Impfstoffe werden ohne zusätzliche Unterstützung durch anti-virale Substanzen möglicherweise nicht in der Lage sein, das PV Ausrottungsprogram zu vollenden. Daher scheint es wichtig, sich auf die Entwicklung anti-viraler Substanzen gegen Picornaviren zu konzentrieren. Bis jetzt haben sich solche Versuche auf die beiden picornaviralen Proteine 3Cpro (Proteinase) und die 3Dpol (Polymerase) konzentriert. Diese Enzyme sind in allen Picornaviren an verschiedenen Schritten des viralen Lebenszyklus beteiligt. Eine vor kurzem erschienene Arbeit (Crowder and Kirkegaard, (2005) Nature Genetics, 37, 701-709) deutet aber darauf hin, daß die Proteinase 2A pro von PV, CV und HRV ein exzellentes Ziel für anti-virale Substanzen sein könnte. 2Apro spaltet das virale Polyprotein nur einmal. Trotzdem sollte die Hemmung dieser Spaltung zu einem übergroßen Kapsidprotein führen, das den Zusammenbau der Nachkommen verhindert. Selbst wenn das Enzym nur partiell inhibiert wird, sollte die Wirkung der verlängerten Kapsidproteine auf die virale Infektiösität signifikant sein. Eine ähnliche Wirkung ist mit Inhibitoren der Lbpro zu erwarten. Ziel dieses Projekts ist es, die strukturbiologischen, biochemischen und virologischen Daten zu generieren, um 2Apro und Lbpro zu therapeutischen Zielen zu machen. Die Selbstspaltung von beiden Proteinasen läuft intramolekular ab; Proteinstrukturen, die den Mechanismus dieser Reaktion erklären, sind nicht vorhanden. Wir werden mittels Röntgenanalyse versuchen, die Strukturen von 2A pro zu ermitteln, welche N-terminale Verlängerungen vom vorangehenden Protein besitzen. Rekombinante VP1-2A pro Proteine von PV, CV sowie den drei genetischen Gruppen der HRV werden verwendet, um die Erfolgschancen zu erhöhen und den Informationsgewinn zu maximieren. Kernspinresonanz (KSR) wird eingesetzt werden, um die Selbstspaltung der Lbpro zu untersuchen. Außerdem wird die Verwandtschaften der 2Apro über deren Empfindlichkeit gegenüber einem spezifischen Inhibitor überprüft. Im Rahmen des Projektes werden wir auch Derivate dieses Inhibitors herstellen. Auch die Rolle von C-terminalen Extensionen auf die Substratspezifität wird geprüft werden. 2A pro und Lbpro spalten auch ein zelluläres Molekül, eIF4G, eukaryotischer Initiationsfaktor 4G. Wir werden KSR einsetzen, um festzustellen, wie ein Fragment von eIF4G mit seinem Bindungspartner eIF4E und Lbpro wechselwirkt. Die Kombination von strukturbiologischen, biochemischen und virologischen Ergebnissen sollte das Wissen generieren, das in der Zukunft für die Entwicklung von anti-viralen Substanzen verwendet werden kann.

Die Familie der Picornaviren umfasst wichtige Human- und Tierpathogen wie Poliovirus (PV), humanes Rhinovirus (HRV), Coxsackievirus (CV) und das Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV). Impfstoffe wurden bisher erfolgreich gegen PV und MKSV eingesetzt, gegen HRVs und CVs wurden aber bisher keine entwickelt. Darüber hinaus sind die MKSV Impfstoffe nur unter bestimmten Bedingungen einsetzbar; PV Impfstoffe werden ohne zusätzliche Unterstützung durch antivirale Substanzen möglicherweise nicht in der Lage sein, PV auszurotten. In diesem Projekt untersuchten wir zwei antivirale Kandidaten, die Proteinase 2A pro von PV, HRV und CV und die Leader Proteinase (L pro ) von MKSV. Die 2Apro befreit sich durch Selbstspaltung am eigenen N-Terminus von der wachsenden Peptidkette. Wir haben damit begonnen die Kristallstruktur der inaktiven 2Apro , die eine Verlängerung des N-Terminus besitzt, zu ermitteln. Wir konnten große Mengen dieses Proteins herstellen. Leider bildete dieses Protein keine Kristalle und wir blieben in diesem Vorhaben erfolglos. Mit der 2Apro konnten wir aber zeigen, dass die Spaltstelle für das HRV14 Enzym vom HRV2 Enzym nicht akzeptiert wird. Das deutet darauf hin, dass die Enzyme, trotz der ähnlichen Struktur, unterschiedliche Spezifitäten besitzen. Am Bedeutsamsten ist jedoch die Erkenntnis, dass das HRV2 Enzym eher die Form und Größe der Aminosäure an der Spaltstelle erkennt als die spezifische Aminosäure an sich. Diese Ergebnisse haben Konsequenzen für die Entwicklung von antiviralen Wirkstoffen. Mit der Lpro haben wir mit einer brasilianischen Gruppe zusammen gearbeitet, um die exakte Spezifität des Enzyms zu untersuchen. Diese Information konnten wir dann dazu verwenden, um einen potenten Inhibitor zu entwickeln und seine Struktur, gebunden an das Enzym, zu untersuchen. Das zeigte zum ersten Mal wie das Enzym sein Substrat auf beiden Seiten der Spaltbindung erkennt und liefert uns wiederum Informationen für den weiteren Entwurf von antiviralen Wirkstoffen. Des Weiteren untersuchten wir die Selbstspaltung von Lpro und konnten zum ersten Mal belegen, dass es sich um eine intramolekulare handelt. Im abschließenden Teil untersuchten wir auch die Struktur des zellulären Proteins namens "eukaryotischer Initiationsfaktor 4G (eIF4G)". Dieses Protein wird von der 2Apro und der Lpro spezifisch geschnitten. Dennoch wird der Mechanismus dieser Spaltung schlecht verstanden. Wir haben ein passendes Fragment des eIF4G Proteins hergestellt, das für NMR Experimente entsprechend markiert wurde und konnten damit zeigen, dass das Protein teilweise strukturiert ist und teilweise unstrukturiert ist. Ca 50 der 200 Aminosäuren wurden zugeordnet, allerdings erlaubte die Komplexität des Moleküls es nicht die restlichen Signale zuzuordnen. Man weiß, dass die eIF4G Spaltung durch ein anderes zelluläres Protein, eIF4E, gefördert wird. In Vorversuchen konnten wir durch Zugabe von eIF4E Änderungen der eIF4G Signale detektieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Verfahren Erkenntnisse über die Spalt-Mechanismen von Lpro und 2Apro bringt und erklären soll, warum die Spaltung durch die Zugabe von eIF4E gesteigert wird.