Funktionsanalyse des Laminin B1 IRES in der Tumorprogression

Die Kontrolle der Translation ist eine entscheidende Schaltstelle für die Regulation der Genexpression, und tritt in einer Vielzahl von essenziellen zellulären Prozessen auf. Die Initiation der Translation durch zelluläre "Internal Ribosome Entry Sites" (IRESs) stellt einen speziellen Mechanismus dar, der durch einzigartige RNA Strukturen in nicht-translatierten Regionen (UTRs) der "Messenger (m)RNAs" die selektive Proteinsynthese erlaubt. IRES Motive sind für die Tumorentwicklung von besonderer Bedeutung, nachdem die Produktion von regulatorischen (Onko)proteinen wie beispielsweise c-myc mittels IRES Elementen gesteuert werden. In vorangegangenen Untersuchungen ist es uns gelungen, die IRES-vermittelte Kontrolle der Laminin B1 (LamB1) Translation während der Tumorprogression zu identifizieren. Diese Daten zeigen, dass die gesteigerte Produktion des extrazellulären Matrixproteins LamB1 von einem bisweilen nicht näher charakterisiertem bona fide IRES Element im 5`-UTR der LamB1 mRNA abhängig ist. In diesem Projekt wollen wir das Sequenzmotiv des LamB1 IRES mit genetischen Analysen bestimmen. Die Kenntnis des cis-aktiven regulatorischen IRES Elements wird in einem weiteren Schritt die Identifikation von trans-agierenden Faktoren, die mit dem LamB1 IRES physikalisch interagieren, ermöglichen. Darüber hinaus wollen wir in weiteren Untersuchungen der Frage nachgehen, welche Signalkaskaden der Tumorprogression für die individuelle Funktionalität des LamB1 IRES und damit der spezifischen Proteinsynthese verantwortlich sind. Das Wissen um den molekularen Mechanismus der IRES-getriebenen LamB1 Translation und dessen möglichen Aberrationen könnte ein bedeutender Schritt für das Verständnis der Tumorprogression sein, der für zukünftige therapeutische Konzepte von Bedeutung ist.

Die Translation ist ein wichtiger Mechanismus der Genexpression und wird hauptsächlich auf dem Niveau der Translations-Initiation reguliert. Internal Ribosome Entry Sites (IRESs) sind regulatorische Strukturelemente in 5-nicht-translatierten Regionen (5-UTRs) einzelner Messenger (m)RNAs, die eine selektive Kontrolle der de novo Proteinsynthese durch Kappen-unabhängige Translations-Initiation erlauben. Vorwiegendes Ziel dieses Projekts war die funktionelle Analyse des IRES im 5-UTR der extrazellulären Matrix-Komponente Laminin B1 (LamB1) während der epithelial zu mesenchymalen Transition (EMT) von malignen Hepatozyten, einem wichtigen Prozess in der Progression und Metastasierung des hepatozellulären Karzinoms (HCC). In diesen Untersuchungen konnte ein bona fide LamB1 IRES durch Messung der LamB1 IRES Aktivität in zwei unabhängigen bicistronischen Reportersystemen sowie durch Ausschluss von möglichen Einflüssen kryptischer Promoter- und Spleißelemente auf die IRES getriebene LamB1 Translation nachgewiesen werden. Durch Deletionen wurde das minimale LamB1 IRES Motiv zwischen Base -293 und -1 stromaufwärts des Startkodons lokalisiert. RNA Affinitäts-Studien zeigten eine physikalische Interaktion des LamB1 IRES mit dem La Protein, die zunehmend während der EMT maligner Hepatozyten beobachtet wird und die Translation des LamB1 IRES verstärkt. Platelet-derived growth factor (PDGF) erhöht die IRES Aktivität des LamB1 durch die steigende zytoplasmatische Lokalisation von La während der hepatozellulären EMT. Demnach ist in Zellen mit dominant-negativer PDGF Rezeptor Expression eine geringe zytoplasmatische Akkumulation von La beobachtbar, weil die LamB1 IRES Aktivität und endogene LamB1 Menge durch PDGF nicht stimuliert werden kann. Weiters wird die La-vermittelte LamB1 IRES Aktivität durch den MAPK/ERK Signalweg, stromabwärts des PDGF, positiv moduliert. Generell ist dabei die LamB1 Expression durch den Translations-Initiationsfaktor eIF4E nicht reguliert. Eine experimentelle Interferenz mit La erniedrigt die LamB1 Expression und damit das Tumorwachstum in vivo. Die Ergebnisse beweisen erstmals, dass der PDGF/MAPK/ERK Signalweg für die zytoplasmatische Translokation von La erforderlich ist, um die IHRES-abhängige Translation von LamB1 während der EMT und HCC Progression zu steuern. Die pharmakologische Intervention mit PDGF/LamB1 könnte daher von großer Bedeutung für die HCC Therapie sein.