Protozoennachweis mit in situ Hybridisierung

Protozoäre Krankheiten sowie Krankheiten die durch morphologisch ähnliche Organismen verursacht sind, die phylogenetisch zu den Pilzen oder Algen gehören, kommen bei Tieren häufig vor. Vorliegendes Projekt zielt auf eine Verbesserung der Methoden zum Nachweis solcher Organismen in Paraffin-eingebetteten Geweben ab. Diese histopathologische Standardtechnik erlaubt neben der Herstellung von Schnittpräparaten auch die Langzeitlagerung von Probenmaterial. Vor allem bestimmte Protozoen der Stämme Parabasala, Metamonada, Amoebozoa und Alveolata, so wie einige den Pilzen oder Algen zugeordneten Pathogene sind mit Standardfärbetechniken schwierig zu diagnostizieren. Dies ist vor allem auf uncharakteristische Morphologie oder ausgesprochene Kleinheit zurückzuführen, wodurch diese Erreger sich häufig nicht gut von Gewebestrukturen abheben. Zusätzlich ist es so nicht möglich, pathogene Vertreter von morphologisch ähnlichen Symbionten ohne krankmachende Eigenschaften zu unterscheiden. Zur spezifischen Identifikation von Protozoen in Geweben werden häufig Methoden wie Immunhistochemie oder PCR eingesetzt. Die Immunhistochemie ist von qualitativ hochwertigen Antikörpern abhängig; solche stehen jedoch für eine Reihe von Pathogenen mit überwiegend veterinärmedizinischer edeutung nicht zur Verfügung. Mit der PCR werden molekulare Signale detektiert, die aber nicht mit Gewebslokalisationen oder pathologischen Veränderungen korreliert werden können. Wir schlagen die Anwendung der chromogenen in situ Hybridisierung (ISH) als ein neues Hilfsmittel für die Identifikation von Protozoen in Gewebsschnitten vor. Als Gensonden setzen wir auf Digoxigenin-markierte Oligonukleotide. Die Vorteile solcher Sonden im Vergleich mit anderen spezifischen Detektionssystemen, wie etwa Antikörper, sind (1) hohe Flexibilität im Design - praktisch jede Nukleotid-Sequenz ist möglich, (2) rasche und kostengünstige Synthese durch zahlreiche Biotechnologie-Firmen, und (3), dass die immunhistochemische Detektion der Digoxigeninmoleküle ein dauerhaftes Farbsignal generiert, welches auch Monate und Jahre nach der Reaktion re-analysiert werden kann. Die ISH selbst hat im Vergleich mit reinen molekularen Detektionsmethoden, wie PCR, den enormen Vorteil, dass spezifische Erregerdetektion mit gleichzeitiger Beurteilung der Gewebsmorphologie kombiniert wird. Das ist eine notwendige Grundvoraussetzung für das Abschätzen der pathogenen Bedeutung von Protozoen, die mit dieser Technik eindeutig mit durch sie induzierten Gewebsläsionen korreliert werden können. Im Rahmen dieses Projekts wollen wir evaluieren, ob Sonden, die zur Hybridisierung mit protozoärer ribosomaler RNA designed wurden, in der praktischen Anwendung in der Lage sind, Protozoen auf unterschiedlichen hierarchischen Levels, wie Spezies, Genus, Familie, oder eventuell höher, zu identifizieren. Während vielfach die Speziesidentifikation von Erregern angestrebt wird, ist im diagnostischen Umfeld häufig eine schrittweise Vorgangsweise günstiger, wo eine Zuordnung zu einer bestimmten Familie oder einem bestimmten Genus erst den Weg zu einer Speziesidentifikation ebnet. Dieses Ziel soll durch rigorose Tests der synthetisierten Sonden an definierten Referenzproben erreicht werden. Im speziellen und mehr angewandten Teil des Projekts wird überprüft, ob ausgewählte Protozoen und andere Organismen in routinemäßig eingebetteten und archivierten Gewebeproben bestimmter Tiergruppen mit bestimmten Krankheitsbildern nachweisbar sind. Wir konzentrieren uns auf ausgewählte Protozoen und andere Organismen mit veterinärmedizinischer Bedeutung, welche sich teils durch zoonotisches Potenzial auszeichnen, wie Trichomonaden, Giardia spp., Hexamita spp., Entamoeba spp., Leishmania spp., Plasmodiidae, Pneumocystis spp. und Prototheca spp. Unsere Hypothese ist, dass Infektionen mit einigen dieser Organismen unterbewertet werden, weil sie mit den gegenwärtig geübten Routineuntersuchungen übersehen werden und mitunter durch sie verursachte Gewebsläsionen nicht der Aktivität dieser Erreger zugeschrieben werden. Die längerfristige Vision, für welche vorliegendes Projekt als erster Schritt gelten kann, ist der Aufbau einer modularen "Toolbox" mit zahlreichen rigoros validierten Sonden, welche eine Identifikation aller in Mitteleuropa relevanten Protozoen ermöglichen sollten. Wir meinen, dass dieses Konzept, welches zunächst einmal Erreger von veterinärmedizinischer Bedeutung im Visier hat, auch breite Anwendung in der experimentellen und Human- Protozoologie finden könnte.

Protozoäre Krankheiten sowie Krankheiten die durch morphologisch ähnliche Organismen verursacht sind, die phylogenetisch zu den Pilzen oder Algen gehören, kommen bei Tieren häufig vor. Vorliegendes Projekt zielt auf eine Verbesserung der Methoden zum Nachweis solcher Organismen in Paraffin-eingebetteten Geweben ab. Diese histopathologische Standardtechnik erlaubt neben der Herstellung von Schnittpräparaten auch die Langzeitlagerung von Probenmaterial. Vor allem bestimmte Protozoen der Stämme Parabasala, Metamonada, Amoebozoa und Alveolata, so wie einige den Pilzen oder Algen zugeordneten Pathogene sind mit Standardfärbetechniken schwierig zu diagnostizieren. Dies ist vor allem auf uncharakteristische Morphologie oder ausgesprochene Kleinheit zurückzuführen, wodurch diese Erreger sich häufig nicht gut von Gewebestrukturen abheben. Zusätzlich ist es so nicht möglich, pathogene Vertreter von morphologisch ähnlichen Symbionten ohne krankmachende Eigenschaften zu unterscheiden. Zur spezifischen Identifikation von Protozoen in Geweben werden häufig Methoden wie Immunhistochemie oder PCR eingesetzt. Die Immunhistochemie ist von qualitativ hochwertigen Antikörpern abhängig; solche stehen jedoch für eine Reihe von Pathogenen mit überwiegend veterinärmedizinischer Bedeutung nicht zur Verfügung. Mit der PCR werden molekulare Signale detektiert, die aber nicht mit Gewebslokalisationen oder pathologischen Veränderungen korreliert werden können. Wir schlagen die Anwendung der chromogenen in situ Hybridisierung (ISH) als ein neues Hilfsmittel für die Identifikation von Protozoen in Gewebsschnitten vor. Als Gensonden setzen wir auf Digoxigenin-markierte Oligonukleotide. Die Vorteile solcher Sonden im Vergleich mit anderen spezifischen Detektionssystemen, wie etwa Antikörper, sind (1) hohe Flexibilität im Design - praktisch jede Nukleotid-Sequenz ist möglich, (2) rasche und kostengünstige Synthese durch zahlreiche Biotechnologie-Firmen, und (3), dass die immunhistochemische Detektion der Digoxigeninmoleküle ein dauerhaftes Farbsignal generiert, welches auch Monate und Jahre nach der Reaktion re-analysiert werden kann. Die ISH selbst hat im Vergleich mit reinen molekularen Detektionsmethoden, wie PCR, den enormen Vorteil, dass spezifische Erregerdetektion mit gleichzeitiger Beurteilung der Gewebsmorphologie kombiniert wird. Das ist eine notwendige Grundvoraussetzung für das Abschätzen der pathogenen Bedeutung von Protozoen, die mit dieser Technik eindeutig mit durch sie induzierten Gewebsläsionen korreliert werden können. Im Rahmen dieses Projekts wollen wir evaluieren, ob Sonden, die zur Hybridisierung mit protozoärer ribosomaler RNA designed wurden, in der praktischen Anwendung in der Lage sind, Protozoen auf unterschiedlichen hierarchischen Levels, wie Spezies, Genus, Familie, oder eventuell höher, zu identifizieren. Während vielfach die Speziesidentifikation von Erregern angestrebt wird, ist im diagnostischen Umfeld häufig eine schrittweise Vorgangsweise günstiger, wo eine Zuordnung zu einer bestimmten Familie oder einem bestimmten Genus erst den Weg zu einer Speziesidentifikation ebnet. Dieses Ziel soll durch rigorose Tests der synthetisierten Sonden an definierten Referenzproben erreicht werden. Im speziellen und mehr angewandten Teil des Projekts wird überprüft, ob ausgewählte Protozoen und andere Organismen in routinemäßig eingebetteten und archivierten Gewebeproben bestimmter Tiergruppen mit bestimmten Krankheitsbildern nachweisbar sind. Wir konzentrieren uns auf ausgewählte Protozoen und andere Organismen mit veterinärmedizinischer Bedeutung, welche sich teils durch zoonotisches Potenzial auszeichnen, wie Trichomonaden, Giardia spp., Hexamita spp., Entamoeba spp., Leishmania spp., Plasmodiidae, Pneumocystis spp. und Prototheca spp. Unsere Hypothese ist, dass Infektionen mit einigen dieser Organismen unterbewertet werden, weil sie mit den gegenwärtig geübten Routineuntersuchungen übersehen werden und mitunter durch sie verursachte Gewebsläsionen nicht der Aktivität dieser Erreger zugeschrieben werden. Die längerfristige Vision, für welche vorliegendes Projekt als erster Schritt gelten kann, ist der Aufbau einer modularen "Toolbox" mit zahlreichen rigoros validierten Sonden, welche eine Identifikation aller in Mitteleuropa relevanten Protozoen ermöglichen sollten. Wir meinen, dass dieses Konzept, welches zunächst einmal Erreger von veterinärmedizinischer Bedeutung im Visier hat, auch breite Anwendung in der experimentellen und Human- Protozoologie finden könnte.