Molekulare Interaktionen innerhalb der Pore von Na-Kanälen

Spannungsabhängige Na+ Kanäle sind porenbildende, membranständige Makromoleküle, die den Fluß von Na+ Ionen über die Zellmembran ermöglichen. Sie ermöglichen die Weiterleitung von Erregungsimpulsen zwischen einzelnen Zellen und sind damit grundlegend an der Funktion der Muskulatur und des Nervensystems beteiligt. Die geordnete Funktion dieser Kanäle erfordert einen intaktes "Gatingverhalten", d.h. das fehlerfreie Öffnen und Schließen der Pore. Bei einer Depolarisation der Zellmembran kommt es zunächst zu einer Öffnung der Kanäle. Danach, innerhalb weniger Millisekunden, gehen die Kanäle in einen nichtleitenden Zustand über, der als "schnelle Inaktivierung" bezeichnet wird. Auf molekularer Ebene erfolgt die schnelle Inaktivierung des Kanals durch Verschluss der inneren Porenöffnung durch das intrazelluläre Verbindungsstück zwischen den Domänen III und IV (DIII, DIV). Wenn die Membran für längere Zeit (einige hundert Millisekunden bis einige Minuten) depolarisiert bleibt, gelangt der Kanal in eine Reihe von "langsam inaktivierten" Zuständen. Einer dieser Zustände, den wir als "ultra-langsame Inaktivierung" (IUS) bezeichnen ist extrem langlebig, da das Verlassen des Zustandes bei hyperpolarisierten Potentialen bis zu 20 Minuten benötigt. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass sowohl der Selektivitätsfilter als auch die innere Kanalöffnung am Entstehen von I US beteiligt sind. So erhöht die Mutation K1237E im Selektivitätsfilter des Skelettmuskelnatriumkanals der adulten Ratte erheblich die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von I US. Vor kurzem entdeckten wir, dass bestimmte Mutationen an Position 1575 des DIV S6 Segments die Entstehung von I US in der Mutante K1237E verhindern. Die Position 1575 des DIV S6 Segments liegt wahrscheinlich in unmittelbarer Nachbarschaft zum Selektivitätsfilter. Daher könnte der ultra-langsam inaktivierte Zustand durch eine Interaktion zwischen den Aminosäuren an den Positionen 1575 im DIV S6 Segment und 1237 im Selektivitätsfilter entstehen. Die erwähnte Interaktion scheint auf die Position 1575 beschränkt zu sein, da keine andere Mutation im S6 Segment einen ähnlichen Effekt auf I US hatte. Das eingereichte Projekt soll die genaue Natur der Interaktion zwischen den erwähnten Postitionen untersuchen. Zu diesem Zweck planen wir den Austausch der nativen Aminosäuren an den erwähnten Positionen durch Aminosäuren unterschiedlicher Ladung, Hypdrophobizität sowie verändertem Volumen der Seitenketten. Wir werden auch analysieren in welchem Ausmaß die erwähnte Interaktion durch die Größe der permeierenden Kationen beeinflusst wird. Weitere Untersuchungen sollen die Rolle einer möglichen Interaktion der erwähnten Positionen bei der Entstehung des schnell inaktivierten Zustands aufklären. Wir werden die Methodik der thermodynamischen Mutationszyklusanalyse anwenden, um eine mögliche Kopplung zwischen der Mutation K1237E im Selektivitätsfilter und seriellen Mutationen (zu Cystein oder Alanin) im DIV S6 Segment zu untersuchen. Schliesslich werden wir den Einfluss von seriellen Mutationen im DIV S6 Segment (allein und in Kombination mit K1237E) auf das Bindungsverhalten von Antidepressiva im inneren Vestibulum der Pore testen. Die Daten werden der Verbesserung eines publizierten molekularen Modells der Porenregion des spannungsabhängigen Na+ Kanals dienen und damit unser Verständnis dieses komplexen Moleküls erweitern.

Spannungsabhängige Na+ Kanäle sind porenbildende, membranständige Makromoleküle, die den Fluß von Na+ Ionen über die Zellmembran ermöglichen. Sie ermöglichen die Weiterleitung von Erregungsimpulsen zwischen einzelnen Zellen und sind damit grundlegend an der Funktion der Muskulatur und des Nervensystems beteiligt. Die geordnete Funktion dieser Kanäle erfordert einen intaktes "Gatingverhalten", d.h. das fehlerfreie Öffnen und Schließen der Pore. Bei einer Depolarisation der Zellmembran kommt es zunächst zu einer Öffnung der Kanäle. Danach, innerhalb weniger Millisekunden, gehen die Kanäle in einen nichtleitenden Zustand über, der als "schnelle Inaktivierung" bezeichnet wird. Auf molekularer Ebene erfolgt die schnelle Inaktivierung des Kanals durch Verschluss der inneren Porenöffnung durch das intrazelluläre Verbindungsstück zwischen den Domänen III und IV (DIII, DIV). Wenn die Membran für längere Zeit (einige hundert Millisekunden bis einige Minuten) depolarisiert bleibt, gelangt der Kanal in eine Reihe von "langsam inaktivierten" Zuständen. Einer dieser Zustände, den wir als "ultra-langsame Inaktivierung" (IUS) bezeichnen ist extrem langlebig, da das Verlassen des Zustandes bei hyperpolarisierten Potentialen bis zu 20 Minuten benötigt. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass sowohl der Selektivitätsfilter als auch die innere Kanalöffnung am Entstehen von I US beteiligt sind. So erhöht die Mutation K1237E im Selektivitätsfilter des Skelettmuskelnatriumkanals der adulten Ratte erheblich die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von I US. Vor kurzem entdeckten wir, dass bestimmte Mutationen an Position 1575 des DIV S6 Segments die Entstehung von I US in der Mutante K1237E verhindern. Die Position 1575 des DIV S6 Segments liegt wahrscheinlich in unmittelbarer Nachbarschaft zum Selektivitätsfilter. Daher könnte der ultra-langsam inaktivierte Zustand durch eine Interaktion zwischen den Aminosäuren an den Positionen 1575 im DIV S6 Segment und 1237 im Selektivitätsfilter entstehen. Die erwähnte Interaktion scheint auf die Position 1575 beschränkt zu sein, da keine andere Mutation im S6 Segment einen ähnlichen Effekt auf I UShatte. Das eingereichte Projekt soll die genaue Natur der Interaktion zwischen den erwähnten Postitionen untersuchen. Zu diesem Zweck planen wir den Austausch der nativen Aminosäuren an den erwähnten Positionen durch Aminosäuren unterschiedlicher Ladung, Hypdrophobizität sowie verändertem Volumen der Seitenketten. Wir werden auch analysieren in welchem Ausmaß die erwähnte Interaktion durch die Größe der permeierenden Kationen beeinflusst wird. Weitere Untersuchungen sollen die Rolle einer möglichen Interaktion der erwähnten Positionen bei der Entstehung des schnell inaktivierten Zustands aufklären. Wir werden die Methodik der thermodynamischen Mutationszyklusanalyse anwenden, um eine mögliche Kopplung zwischen der Mutation K1237E im Selektivitätsfilter und seriellen Mutationen (zu Cystein oder Alanin) im DIV S6 Segment zu untersuchen. Schliesslich werden wir den Einfluss von seriellen Mutationen im DIV S6 Segment (allein und in Kombination mit K1237E) auf das Bindungsverhalten von Antidepressiva im inneren Vestibulum der Pore testen. Die Daten werden der Verbesserung eines publizierten molekularen Modells der Porenregion des spannungsabhängigen Na+ Kanals dienen und damit unser Verständnis dieses komplexen Moleküls erweitern.