Interaktionen von STIM und ORAI

Die Identifizierung der molekularen Basis von durch Ca2+-Freisetzung aktivierten Kanäle (CRAC) steht erst am Anfang. In den letzten beiden Jahren haben sich mit Hilfe von siRNA knock-down Strategien das Stromal Interaction Protein (STIM1) und ORAI1 (oder CRACM1) als essentielle Teile des CRAC Komplexes herauskristallisiert. STIM1 ist ein ER-lokalisierter Ca2+-Sensor und ORAI1, welches vier Transmembranregionen besitzt, scheint die Pore oder zumindest Teil der CRAC Pore zu sein. In diesem Projekt werden wir uns im besonderen auf die Identifizierung von intra- und intermolekularen Wechselwirkungen zwischen STIM1 und ORAI1 im Standardexpressionssystem HEK293 konzentrieren, um hiermit minimale Schlüsseldomänen zu charakterisieren, die für deren Assemblierung und Funktion von Bedeutung sind. Hierfür setzen wir kombiniert verschiedene Technologien ein, ausgehend von Elektrophysiologie, Ca2+- Imaging, konfokale FRET und TIRF Mikroskopie bis zu Molekularbiologie und biochemischen Methoden. Für eine detailliertes Mapping von relevanten Interaktionsdomänen verwenden wir zusätzlich die Peptide Array SPOT Technik. Weiters setzen wir Röntgenstrahlbeugung an kristallisierten STIM1 und ORAI1 Fragmenten ein, um deren 3-dimensionale Struktur alleine oder in einem interagierenden Komplex aufzulösen. Diese Studien werden auch auf ORAI2 und ORAI3 ausgedehnt, um durch einen Vergleich der beteiligten Domänen mit deren von ORAI1 möglicherweise unterschiedliche Funktionsweisen erklären zu können. Durch die Identifizierung von Schlüsseldomänen, die an der STIM1/ORAI1 Aktivierung beteiligt sind, wird die Basis geschaffen, endogene CRAC Ströme von nativen Zellen spezifisch zu manipulieren. Rat Basophilic Leukemia (RBL) Mast Zellen werden hierfür als Modellsystem benützt, da an deren CRAC Strom im wesentlichen STIM1 und ORAI1 Proteine beteiligt sind.

Die Identifizierung der molekularen Komponenten des "store-operated" or "Ca2+ release activated" Kanäle (SOC or CRAC) hat gerade begonnen. Während Mitglieder der "transient receptor potential (TRP) Ionenkanal-Familie einschließlich der TRPCs und des TRPV6 Kanals als Komponenten vorgeschlagen warden, wurden mittels siRNA "knock-down" Strategie das "stromal interaction molecule 1 (STIM1) und Orai1 als essentielle Bestandteile des CRAC Kanal Komplexes identifiziert. STIM1 ist ein ER-ständiger Ca2+-Sensor und Orai1 bestehende aus vier Transmembranregionen repräsentiert die CRAC Pore. In diesem Projekt fokusierten wir uns auf die Identifizierung von intra- und inter-molekularen Interaktionen von STIM1 und Orai und analysierten im HEK293 Zellexpressions-System die Schlüsseldomänen, die zur Assemblierung und Funktion dieser beiden Proteine etwas beitragen. Dafür verwendeten wir eine Kombination von Techniken, reichend von Elektrophysiologie, Ca2+ imaging, konfokaler FRET Mikroskopie bis zu molekularbiologischen und biochemischen Methoden. Signifikante Resultate wurden erhalten hinsichtlich (i) der minimalen Domäne von STIM1, die mit Orai1 interagiert, (ii) den Domänen innerhalb von STIM1 und Orai1, die deren Interaktion bewerkstelligen, (iii) einer modulatorischen Domäne, die die schnelle Inaktivierung von Orai Kanälen bewirkt, (iv) der heteromeren Assemblierung von Orai1/Orai3 Proteinen, die zu einer geänderten Ca2+-Selektivität führt und (v) der Stöchiometrie des Orai1 Kanals in Abhängigkeit dessen Aktivierung durch STIM1. Die Identifizierung dieser Schlüsseldomänen stellte die Basis dar, um endogene CRAC Kanäle in native Zellen spezifisch zu manipulieren. "Rat Basophilic Leukemie (RBL) Mast Zellen wurden hierfür als Modellsystem verwendet, um zu zeigen, wie STIM/Orai Fragmente oder Mutanten endogene CRAC Ströme beeinflussen können.