Biosynthese der Phosphatidsäure in Hefe

In Eukaryonten gibt es zwei nach ihren Ausgangssubstraten benannte Wege der de-novo-Synthese von Phosphatidsäure (PtdOH): a) den Glycerin-3-phosphat- (Gro3P), und b) den Dihydroxyacetonphosphat- (GrnP) Weg. Die Umsetzung von Gro3P zu PtdOH erfolgt durch zwei Acylierungsschritte, während an der PtdOH Biosynthese über den GrnP Weg noch ein weiteres Enzym beteiligt ist, welches das Zwischenprodukt 1-Acyl-GrnP zu 1-Acyl-Gro3P reduziert. In allen eukaryotischen Zellen kommen Enzyme, die an der Bildung von PtdOH beteiligt sind, in mehrfacher Ausführung vor. Dies gilt auch für die Hefe Saccharomyces cerevisiae, welche als Modell für das hier vorgestellte Projekt dienen wird. Bisher wurden in der Hefe bereits einige Enzyme, die die Hauptaktivitäten im Prozess der PtdOH Bildung aufweisen, auf molekularer Ebene identifiziert. Enzymatische Messungen deuten darauf hin, dass an diesem Prozess noch weitere nicht identifizierte und charakterisierte Enzyme beteiligt sind. Dieses Projekt hat zum Ziel diese Redundanz der Enzyme zu erklären. Folgende Fragen gilt es dafür zu beantworten: a) Gibt es ein bevorzugtes Zusammenspiel von einzelnen an der Bildung von PtdOH beteiligten Enzyme? b) Führt ein bevorzugtes Zusammenspiel von Enzymen zur Bildung von so genannten PtdOH "Pools", die weiter in spezifische Stoffwechselwege fließen? Und c) Wie ist der Vorgang der PtdOH Biosynthese reguliert? Um den komplexen Vorgang der PtdOH Biosynthese zu verstehen ist es notwenig alle an diesem Prozess beteiligten Proteine zu kennen. Daher werden verschiedene "Screening" Methoden und Bioinformatik, sowie molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Methoden eingesetzt, um diese noch unbekannten Proteine zu identifizieren und zu charakterisieren. Um das Zusammenspiel der Proteine (Organelle) während der PtdOH Bildung zu untersuchen, wird die subzelluläre Verteilung der Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie (Markierungstechnik) und Zellfraktionierungen (Western Blot Analysen und enzymatische Messungen) bestimmt werden. Untersuchungen der Wachstumsphänotypen verschiedener Mutanten, die Defekte in der PtdOH Synthese aufweisen, und Lipidprofil-Analysen der Zellorganelle dieser Mutanten werden Hinweise liefern, ob verschiedene PtdOH-Pools für die Synthese spezifischer Glycerolipide gebildet werden könnten. Resultate aus DNA Microarray Experimenten, bei welchen Genexpressionsprofile von Mutanten mit Defekten in der PtdOH Biosynthese untersucht werden, werden ebenfalls zeigen ob es durch ein bevorzugtes Zusammenspiel von Enzymen zur Bildung spezifischer PtdOH-Pools kommt. Weiters will dieses Projekt auch regulatorische Aspekte der PtdOH Biosynthese beleuchten, die mittels molekularbiologischer Methoden im Detail untersucht werden. Zusammengefasst, die mit dieser Studie über die PtdOH Biosynthese gewonnenen Erkenntnisse werden zu einem Modell führen, welches wichtige Informationen für ähnlichen Studien in höheren eukaryotischen Systeme enthalten wird.

Die Biosynthese der Phosphatidsäure ist von höchster Wichtigkeit, da dieser Stoffwechselweg für die Bildung aller Glycerophospholipide und Triglyceride benötig wird. Glycerophospholipide dienen dem Aufbau von Biomembranen, während Triglyceride wichtige Speicherstoffe darstellen. Zusätzlich nimmt die Phosphatidsäure eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion ein. Ausgehend von Glycerin-3-phosphat wird Phosphatidsäure über zwei Acylierungsschritte gebildet, welche von einer Glycerin-3-phosphat Acyltransferase (GPAT) und einer 1-Acyl-glycerin-3-phosphat Acyltransferase (AGPAT) katalysiert werden. In allen Eukaryoten sind mindestens zwei GPAT- und AGPAT Isoenzyme vorhanden. Das Hauptziel dieses Projekts war es zu untersuchen ob diese redundanten Enzyme einen unterschiedlichen Beitrag zum Lipid-/Zellmetabolismus leisten. Diese Studien wurden im Modellorganismus Hefe, Saccharomyces cerevisiae, durchgeführt. In Hefe wird die erste und geschwindigkeitsbestimmende Reaktion der Phosphatidsäure Biosynthese durch zwei GPAT Isoenzyme, Sct1p und Gpt2p, katalysiert. In dieser Studie zeigte sich, dass die Überexpression von SCT1 das Zellwachstum stark beeinträchtigt. Es stellte sich heraus, dass unter diesen Bedingungen die Genexpression von etwa 20% aller Gene signifikant verändert wurde. Eine Gruppe dieser Gene codierte für Polypeptide, welche eine Rolle im Lipidmetabolismus spielen. Detaillierte Untersuchungen der Proteine dieser Gruppe führten zur Identifizierung einer weiteren AGPAT, welche eine wichtige Rolle in Zellen mit SCT1-Überexpression spielt. Des Weiteren wurde beobachtet, dass der Expressionsgrad von SCT1 einen wesentlichen Einfluss auf den Grad der Phosphorylierung von Sct1p hat. Dies deutete darauf hin, dass die Aktivität von Sct1p über den Proteinphosphorylierungsgrad gesteuert wird. In diesem Projekt konnte eine Haupt-Phosphorylierungsstelle in Sct1p identifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass der Beitrag von Sct1p zum Lipid-/Zellmetabolismus über den Grad der Proteinphosphorylierung reguliert wird.Die zweite GPAT der Hefe, Gpt2p, ist essentiell für ein Zellwachstum auf ölsäurehaltigen Medien. Ölsäure führt zu einer verstärkten Bildung von Triglyceriden, Moleküle, welche intrazellulär in sogenannten Lipidtröpfchen gespeichert werden. Von früheren Studien unseres Labors ist bekannt, dass Gpt2p in der Zelle sowohl mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) als auch mit Lipidtröpfchen assoziiert ist. Eine wesentliche Erkenntnis dieses Projekts war, dass in Zellen, welche auf ölsäurehaltigen Medien wuchsen, die duale Lokalisierung von Gpt2p verloren ging, und sich das Enzym ausschließlich in grubenartigen Strukturen des ERs befand, welche in engem Kontakt mit Lipidtröpfchen standen. Zudem wurde beobachtet, dass in diesem Medium die Menge an Gpt2p stark erhöht und der Grad der Phosphorylierung dieses Enzymes verringert war. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass -ähnlich wie Sct1p- der Beitrag von Gpt2p zum Lipid-/Zellmetabolismus durch Proteinphosphorylierung gesteuert wird.Zusammenfassend kann gesagt werden, dass GPAT Isoenzyme unterschiedlich zum Lipid-/Zellmetabolismus beitragen, und dass dieser Beitrag über Proteinphosphorylierung reguliert wird.