Zusammenspiel zwischen MMTV und APOBEC3 Proteinen

Wirtsorganismen haben eine Vielzahl an Strategien entwickelt um viralen Infektionen entgegen zu wirken. Neben angeborener und adaptiver Immunantwort, können virale Infektionen auch durch die Präsenz von intrazellulären Faktoren inhibiert werden. Die An- bzw. Abwesenheit dieser "intrazellulären Immunantwort" bestimmt daher die Toleranz eines Wirtes für eine virale Infektion. Kürzlich wurde eine Reihe von spezifisch intrazellulären anti-retroviralen Resistenzmechanismen beschrieben. Zum Beispiel kann eine retrovirale Infektion kurz nach dem Zelleintritt durch das zelluläre Protein "tripartite motif protein 5 alpha" (TRIM5a) inhibiert werden. Bei einem weiteren zellulären Faktor handelt es sich um Tetherin, ein Protein das die Freisetzung von neuen retroviralen Partikeln an der Oberfläche von infizierten Zellen inhibiert. Mitglieder der Cytidin-Deaminase-Familie APOBEC3 (A3; "apoliprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide") können neben Retroviren auch endogen mobile Retroelemente inaktivieren. Während der reversen Transkription kommt es, durch A3 Proteine verursacht, zu einer Akkumulation an extensiver Mutationen im wachsenden retroviralen Genom. Ein Beta-Retrovirus, "Mouse Mammary Tumor Virus" (MMTV), der kürzlich mit einigen humanen Erkrankungen wie Brustkrebs, humanem T-Zellen Lymphom und primärer biliärer Zirrhose in Zusammenhang gebracht wurde, wird ebenfalls durch A3 Proteine inhibiert. Obwohl es sich bei MMTV um den bis jetzt einzigen Retrovirus handelt, bei dem eine Inhibierung durch humane bzw. murine A3 Proteine auch in vivo nachgewiesen wurde, ist der genaue Mechanismus durch welchen diese Proteine die Viren inaktivieren noch relativ unbekannt. Basierend auf vorläufigen Daten aus unserem Labor bzw. von anderen Gruppen scheint es, dass MMTV (ebenso wie einige andere Retroviren), unabhängig von einer Citidine-zu-Uracil Konvertierung inhibiert wird. Durch das beantragte Projekt versuchen wir ein genaueres Verständnis über die A3 vermittelten Mechanismen gegen eine MMTV Infektion zu erlangen. Genauer wollen wir versuchen die Hypermutationsraten, die Ansammlung von Produkten der reversen Transkription, den nuklearen Import von viraler DNA, die Menge an integrierter proviraler DNA und Ansammlungen von anormalen Autointegrationsprodukten in An- bzw. Abwesenheit von A3 Proteinen zu analysieren. MMTV ist als ein einfacher Retrovirus klassifiziert und kodiert daher nicht für akzessorische Protein wie zum Beispiel Vif von HIV-1, welches HIV-1 vor A3 Proteinen schützt. Daher ist es noch völlig ungeklärt, wie einfache Retroviren ohne Expression eines Vif-homologen Proteins den A3 Proteinen entgegenwirken. Um diese Frage zu klären planen wir selektierte Regionen innerhalb des MMTV Genoms zu mutieren (ohne die Expression strukturaler Gene zu beeinflussen) und wollen diese Mutationen in Bezug auf das Replikationsverhalten in der Anwesenheit von A3 Proteinen untersuchen. Wir sind davon überzeugt, dass das beantragte Projekt nicht nur eine bessere Einsicht in die grundlegende MMTV Biologie bringen wird sondern, dass die Ergebnisse dieser Studie auch dazu beitragen können, neue Strategien für die Therapie von retroviralen Infektionen (z.B. HIV-1) und anderen humanen Erkrankungen wie Brustkrebs oder primäre biliäre Zirrhose zu entwickeln.

Wirtsorganismen haben eine Vielzahl an Strategien entwickelt um viralen Infektionen entgegen zu wirken. Neben angeborener und adaptiver Immunantwort, können virale Infektionen auch durch intrazelluläre Faktoren inhibiert werden. Das Vorhandensein einer derartigen intrazellulären Immunität bestimmt die Permissivität eines Wirts gegenüber einer viralen Infektion. Eine bedeutende Familie von Restriktionsfaktoren ist die apolipoprotein B messenger RNA editing enzyme catalytic polypeptide (APOBEC) Proteinfamilie. APOBEC in der Maus, sowie APOBEC3G in menschlichen Zellen, katalysiert die Desaminierung von Cytidinen in einzelsträngiger DNA oder RNA. In mit einem Retrovirus infizierten Zellen werden APOBEC-Proteine während der Knospung des Virus enkapsidiert (verpackt) und verursachen extensive Mutationen von Cytidinen zu Uracil während der reversen Transkription. Viren haben jedoch Mechanismen entwickelt um sich weiterhin auch in APOBEC- expremierenden Zellen replizieren zu können. Dazu zählt der Ausschluss von APOBEC Proteinen aus den Virionen sowie der durch einen Virusfaktor (Vif) induzierte proteolytische Abbau von APOBEC Proteinen in infizierten Zellen.Die Autoren untersuchten die Sensitivität des klassischen Betaretrovirus mouse mammary tumor virus (MMTV) gegenüber APOBEC3 Proteinen. Mithilfe eines für hohe Virustiter optimierten MMTV basierten Vektorsystems konnte festgestellt werden, dass MMTV weniger sensitiv gegenüber murinem und humanem APOBEC3 Proteinen ist als HIV?Vif Vektoren. Komplementationstests mit verschiedenen MMTV basierten Expressionskonstrukten und HIV?Vif als Zielvektor haben gezeigt, dass MMTV kein funktionelles Analogon für HIV-1 Vif zum proteolytischem Abbau von APOBEC3 Proteinen kodiert. Darüber hinaus korreliert die niedrigere Sensitivität MMTVs gegenüber APOBEC3 Proteinen mit niedrigeren Cytosin zu Uracil Mutationsraten während der reversen Transkription, obwohl gleiche Mengen an APOBEC3 Proteinen in MMTV und HIV?Vif Virionen verpackt wurden. Die MMTV Mutante F120L, Träger einer Phe-zu-Leu Substitution in der DNA-Polymerase Domäne der reversen Transkriptase, zeigte eine erhöhte Sensitivität gegenüber APOBEC3 Proteinen.Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die relative Insensitivität gegenüber APOBEC3 Proteinen nicht durch Ausschluss der Proteine aus den Virionen oder durch Virusfaktor vermittelten proteolytischen Abbau dieser erreicht wird. Die niedrigere Inhibition von MMTV in der Anwesenheit von APOBEC3 ist stattdessen eine intrinsische Eigenschaft der MMTV reversen Transkriptase. Diese erlaubt keinen effizienten APOBEC3 vermittelten Angriff der entstehenden viralen negativen einzelsträngigen DNA während der reversen Transkription.