Golgi Biogenese und die Polo-like Kinase in T. brucei

Am Golgi Apparat eukaryotischer Zellen treffen exozytotischer und endozytotischer Membrantransport aufeinander. Der Golgi erhält alle neu-synthetisierten Proteine und Lipide des Endoplasmatischen Retikulums (ER), prozessiert die kovalent-gebundenen Oligosaccharide innerhalb der Zisternae und sortiert die Proteine im trans-Golgi Netzwerk (TGN). Vom TGN aus werden die Proteine entweder sekretiert (konstitutive oder regulierte Exozytose) oder in das endosomale-/lysosomale System eingespeist. Wie alle anderen Organellen muss sich der Golgi duplizieren und während der Zellteilung auf die Tochterzellen aufteilen, so dass er an die Folgegeneration weitergegeben wird. Die Verteilung des Golgis in Säugerzellen ist ausgiebig untersucht wurden. Da es aber in Säugerzellen typischerweise mehrere hundert Kopien des Golgis gibt, welche sich in einer Art Band neben den Zellkern und Zentrosom befinden, versteht man aufgrund dieser Koplexität den Mechanismus der Golgi Vervielfältigung kaum. Um den Vorgang der Golgi Duplikation zu erforsche, nutzen wir einzellige, protistische Parasiten, welche häufig nur einen einzigen Golgi Apparat haben, welcher während der Zellteilung vervielfältigt wird. Wir haben gezeigt, dass in T. brucei, dem Erreger der Schlafkrankeit beim Menschen und Nagana bei Tieren, der alte Golgi bei der Konstruktion des neuen Golgi behilflich ist und dass die Stelle, an welcher der neue Golgi zusammengesetzt wird, durch eine neu identifizierte TbCentrin2 und 4 enthaltene "Bilobe" Struktur markiert wird. Centrins sind Calmodulin-ähnliche, Kalzium bindende Proteine, deren Struktur hoch konserviert ist und welche wichtig sind für die Verdopplung und Verteilung des Zentrosoms. Wir können nun die Verdopplung des Golgi Apparates (und mit ihm assoziierte ER-Exit sites) dieser Liste hinzufügen. Wir versuchen zu verstehen, durch welchen Mechanismus sich die "Bilobe" Struktur selbst dupliziert. Wir haben schon die wichtige Entdeckung gemacht, dass das einzige Polo-like Kinase Homolog in T.brucei (TbPLK) essentiell für diesen Prozess ist und dass möglicherweise die Phosphorylierung TbCentrin2`s eine wichtige Rolle dabei spielt. Wir wollen in der Zukunft den genauen Mechanismus verstehen. Unter anderem sollen die genauen TbPLK Phosphorylierungsstellen in TbCentrin2 identifiziert und bestimmt werden und ob Mutationen an diesen Stellen einen Effekt auf die Biogenese des "Bilobe"s und/ oder des Golgis haben. Wir planen dann das Phospopeptid bindende Module TbPLKs zu benutzen, um mögliche TbPLK Bindungspartner zu identifizieren. Auf diesem Wege sollten wir in der Lage sein herauszufinden, wie TbPLK zum "Bilobe" rekrutiert wird und welche neuen Proteine zum "Bilobe" lokalisieren. Desweiteren wollen wir durch ein kleines Molekül die Aktivität TbPLKs spezifisch hemmen, so dass wir die Biogenese des "Bilobes" in lebenden Zellen analysieren können.

Das vorliegende Projekt konnte den eindeutigen Nachweis erbringen, dass das Polo-like Kinasen-Homolog wesentlich an der Zellteilung in Trypanosoma brucei beteiligt ist. Unter Zuhilfenahme verschiedenster biologischer Methoden konnten wir beweisen, dass die Kinase maßgeblich den Aufbau des Zytoskeletts von T. brucei beeinflusst. Das Zytoskelett verleiht der Zelle ihre Form und lässt es im Inneren der Wirtszelle schwimmen. Wir lieferten wichtige Hinweise darauf, wie und wann die Kinase durch die Zelle wandert. Weiters ist es uns gelungen, ein wichtiges Substratprotein zu identifizieren, welches durch TbPLK phosphoryliert wird. Wir konnten nachweisen, wann dies in der Zelle passiert und zeigten, dass sein Ausschalten die Fähigkeit der Zelle zur Teilung unmittelbar beeinflusst. Schließlich fanden wir eine Möglichkeit, die Aktivität von TbPLK mittels eines niedermolekularen Wirkstoffs zu blockieren und so die Zellteilung zu verhindern. Damit konnten wir nachweisen, dass ein Wirkstoff gegen TbPLK eine wirksame Therapie der Krankheit Trypanosomiasis ermöglichen könnte. Trypanosomiasis stellt ein ernsthaftes Problem in Subsahara-Afrika dar, wo der Zugang zu Medikamenten sehr begrenzt ist.